[發明專利]鐮刀菌BYB2及其在微生物發酵制備阿拉伯膠酶中的應用

有效

• 申請號: 201010259769.7
• 申請日: 2010-08-23
• 公開（公告）號: CN101993826A
• 公開（公告）日: 2011-03-30
• 發明（設計）人: 應國清;梅建鳳;廖青青;陳建澍;王鴻;易喻
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12N9/24;C12P19/02;C12R1/77
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;冷紅梅

(一)技術領域

本發明涉及一株新的阿拉伯膠酶產生菌株——鐮刀菌(Fusarium?sp.)BYB2，及其在微生物發酵制備L-阿拉伯糖中的應用。

(二)背景技術

L-阿拉伯糖屬于五碳醛糖，多以阿拉伯聚糖、阿拉伯糖基木聚糖、阿拉伯糖基半乳糖體及類似于高等植物半纖維的形式存在。L-阿拉伯糖是一種低熱量的甜味劑，也是重要的藥物中間體，并且可用于生化領域中細菌培養基的制備以及香料合成等，應用范圍相當廣。但是由于L-阿拉伯糖現有的生產工藝復雜，生產成本高，導致價格居高不下，阻礙了其在食品或醫藥等領域的應用。

目前，L-阿拉伯糖的制備方法有化學合成法和酸解法。化學合成法步驟多，工藝復雜，原材料昂貴。酸解法對反應設備的要求較高，同時產生的混合糖成分復雜，后續分離純化工藝的難度較大。日本三和興產株式會社已于2003年在中國申請了“通過酸水解生產L-阿拉伯糖的方法”的專利，在一定程度上限制了我國采用該技術生產L-阿拉伯糖的產業化應用。L-阿拉伯糖還可以采用酶解法，就是以阿拉伯膠為原料，采用微生物產生的水解酶進行水解，其具有選擇性強，后序處理相對簡單，反應條件溫和等優點，更關鍵的是它可以避開日本傳統酸解法制備的專利保護，是我國生產L-阿拉伯糖的工業化應用的一條途徑。

已見文獻報道的酶法制備L-阿拉伯糖都以廢棄農產品為原料，往往存在L-阿拉伯糖的產率低、分離純化困難等問題。阿拉伯膠是一種來源廣泛的樹膠，其L-阿拉伯糖的含量高達30％以上，是自然界中L-阿拉伯糖含量最高的物質，如以阿拉伯膠為原料，酶解阿拉伯膠生產L-阿拉伯糖的效率將明顯提高。酶法水解阿拉伯膠制備L-阿拉伯糖有著底物專一性強、產物得率高、反應條件溫和等優點，適用于高純度L-阿拉伯糖的大量制備。目前在國內外還未見有關采用酶解阿拉伯膠制備L-阿拉伯糖的報道。采用酶解阿拉伯膠制備L-阿拉伯糖的技術關鍵就是獲得活力高、性能穩定的阿拉伯膠酶，而微生物是獲得阿拉伯膠酶的主要來源，適合酶的大規模工業化生產。因此，篩選產酶活力高、生長繁殖快、營養要求低的微生物菌株發酵產酶，并用阿拉伯膠酶來水解阿拉伯膠制備L-阿拉伯糖具有重要的理論意義和應用價值。

(三)發明內容

本發明提供一株阿拉伯膠酶產生菌株——鐮刀菌(Fusarium?sp.)BYB2，及其在制備L-阿拉伯糖中的應用，較好地克服了L-阿拉伯糖現有的生產工藝復雜，純度低、生產成本高等缺點。

本發明采用的技術方案是：

一株阿拉伯膠酶產生菌——鐮刀菌(Fusarium?sp.)BYB2，保藏于中國典型培養物保藏中心，地址：中國，武漢，武漢大學，430072，保藏編號：CCTCC?NO：M?2010087，保藏日期：2010年4月19日。

所述鐮刀菌BYB2的菌落特征如下：涂布或劃線接種于平板培養基上生長迅速，30℃培養3～5d，長出粉質、粉白色、淺粉色至肉色、略帶有紫色、高為3～5mm的菌落，且菌落在形成初期呈突起絮狀，菌絲白色質密。所述鐮刀菌BYB2的孢子特征如下：小型分生孢子為單胞、卵形、著生方式為單生、產孢細胞為簡單瓶梗，且常在瓶梗頂端聚成球團；大型分生孢子為鐮刀形、少許彎曲、分隔數多為3分隔。

本發明所述鐮刀菌BYB2由浙江省杭州市下城區浙江工業大學校園金合歡(Acacia?farnesiana)樹下土壤中分離和篩選得到野生菌株，再經紫外線照射誘變處理獲得。

野生菌株的分離方法為：在采集的土壤中加入阿拉伯膠進行微生物富集培養，使得土壤中能以阿拉伯膠為唯一碳源生長的微生物數量增加，再將富集培養物稀釋后涂布于以阿拉伯膠為唯一碳源的平板培養基上，30℃培養至菌落數量不再增加，挑取平板上生長較大的菌落接種于斜面培養基上，30℃培養3d，將進一步搖瓶復篩。

用接種環分別挑取初篩的各個菌株新鮮斜面孢子2環，接入液體產酶培養基中，30℃、200r/min振蕩條件下發酵培養3d。將發酵液用濾紙過濾去除菌絲體后，取清液測酶活力，篩選出產酶活力最高的菌株。

所述的平板培養基和斜面培養基組成相同，終濃度組成為：阿拉伯膠25g/L，NaNO₃?3g/L，K₂HPO₄?1g/L，MgSO₄·7H₂O?0.5g/L，KCl?0.5g/L，FeSO₄·7H₂O?0.01g/L，瓊脂20g/L，溶劑為水，pH?6。