[發明專利]一種新型組織特異性小環載體hIFNγ基因治療藥物

無效

• 申請號: 201010259342.7
• 申請日: 2010-08-20
• 公開（公告）號: CN102373232A
• 公開（公告）日: 2012-03-14
• 發明（設計）人: 黃文林;左瑜芳;吳江雪
• 申請（專利權）人: 黃文林;左瑜芳;吳江雪
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/23;A61K48/00;A61P35/00;A61P31/20
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技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，更具體地說是涉及一種由EB病毒特異性啟動子oriP啟動的人IFNγ基因與非病毒類小環載體構建而成的重組體，靶向性抑制鼻咽癌生長的作用研究。

背景技術

基因治療是一種新的治療手段，可用于多種疾病的治療，包括癌癥、遺傳性疾病、感染性疾病、心血管疾病和自身免疫性疾病等。隨著分子生物學技術的進步，腫瘤基因治療在實驗研究和臨床試驗中的應用都有了很大的進展。在基因治療過程中，基因導入系統是最關鍵的技術。目前，在基因導入載體方面主要分為兩大類，即病毒載體系統及非病毒載體系統。國內已經應用于臨床的“今又生”便是一種由腺病毒載體攜帶p53抑癌基因治療多種腫瘤的基因治療試劑。雖然病毒載體作為基因傳遞的工具被廣泛地采納，但仍存在著局限性，可誘導機體產生某種程度的免疫反應，引起插入突變等致瘤及致毒的風險，且載體容量有限，制備滴度不高等。曾經報道的一例死于基因治療的病例便是因腺病毒載體引起的全身炎癥反應導致。因此，需要尋求一種更為安全的基因載體，而非病毒基因載體以其設計靈活、低毒性、低免疫原性、低致瘤性、易制備及可以實現細胞特異性和長期基因表達的優點，為基因治療開辟出一條新的道路。

小環DNA(minicircle?DNA)載體是一種自1997年發展起來的新型非病毒基因載體，與傳統的質粒載體相比，小環DNA載體僅含有外源基因的表達盒，不包括來自細菌質粒的骨架結構。因為該載體所攜帶的外源基因的表達盒以環狀超螺旋的形式存在，所以被稱為小環DNA。小環DNA是由相應的母體質粒(parent?plasmid)在宿主菌內以體內重組的方式產生的。小環DNA的母體質粒的基本結構與常規質粒相同，含有外源基因的表達盒及原核骨架(原核復制起點、抗性基因篩選標記等)，此外，該質粒上還攜帶有一個重組酶的表達盒。重組酶可在宿主菌內被誘導表達，將母體質粒重組成為兩個環狀DNA，分別是攜帶外源基因表達盒的小環DNA和環狀骨架(原核復制起點、抗性基因篩選標記、重組酶的表達盒等)。小環DNA在宿主菌內重組產生后，可通過相應的純化方法與環狀骨架分離，去除環狀骨架的污染。

目前，已構建成功的小環DNA載體系統根據所選用的重組酶的種類不同，可分為3種。它們所采用的整合酶分別是λ噬菌體來源的重組酶、P1噬菌體來源的cre重組酶和鏈霉菌溫和噬菌體來源的φC31整合酶。美國斯坦福大學的Chen?Zhiying等在2003年構建的小環載體系統采用源于鏈霉菌溫和噬菌體的φC31整合酶，這種重組酶所介導的重組過程為單向反應，小環DNA的產率可達97％。這一系統最大的特點在于毋需復雜的純化過程，可由宿主菌內直接提取小環DNA。該系統的母體質粒上攜帶有內切酶I-SceI的表達盒，當φC31整合酶在宿主菌內完成重組過程后，I-SceI可將環狀骨架及少量未重組的母體質粒消化成為線性DNA，這些線性DNA隨后被胞內的外切酶降解。因此，采用這一系統可直接由宿主菌內提取小環DNA，毋需進一步純化，有利于小環DNA的大規模制備。本發明所采用的就是此種小環DNA系統。

研究表明，在超過90％的鼻咽癌組織中可以檢測到EB病毒感染，而在癌旁正常組織中則檢測不到EB病毒的存在。鼻咽癌屬于EB病毒II型潛伏型感染，在攜帶EB病毒的細胞中恒定表達EB病毒核抗原1(EBNA1)蛋白。EBNA1可以使EB病毒的基因組以穩定的附加體形式存在，并參與病毒基因組的復制、核轉移，介導EB病毒對宿主的免疫逃逸。在EB病毒基因組中存在3個EBNA1結合位點，其中親和力最高的是位于oriP序列中的FR區。FR區由20個串聯重復的30bp序列組成，是依賴于EBNA1的轉錄增強子。Li?Jianhua等在2002年構建了帶有FR序列的CMV啟動子(oriP-CMV?promoter)，在鼻咽癌組織中特異表達p53基因，這是首次針對EB病毒陽性的鼻咽癌組織構建特異表達外源基因的基因治療載體。如果把這種啟動子用于改造小環載體，將有望獲得在EB病毒陽性的鼻咽癌組織中高效、持續表達外源基因的靶向性小環載體。

發明內容

Wu?Jiangxue等在2006年首次將小環載體應用于抗腫瘤基因治療，構建攜帶人IFNγ的重組小環DNA載體mc-IFNγ，采用瘤內注射的方式治療鼻咽癌移植瘤荷瘤小鼠，證明小環載體可在腫瘤組織內介導外源基因高效、持續表達，較傳統質粒更有效的抑制鼻咽癌移植瘤的生長。

在此基礎上，本發明將對小環載體進行改進，構建在EB病毒陽性鼻咽癌組織中靶向表達的小環載體，研究靶向小環載體對鼻咽癌的抑制作用，為鼻咽癌等EB病毒陽性的腫瘤的治療提供新的候選藥物。