[發明專利]檢測甲型H1N1流感病毒抗藥性突變的引物和探針及方法

無效

• 申請號: 201010258889.5
• 申請日: 2010-08-20
• 公開（公告）號: CN101928787A
• 公開（公告）日: 2010-12-29
• 發明（設計）人: 陳寅;張嚴峻;盧亦愚;茅海燕;周敏
• 申請（專利權）人: 浙江省疾病預防控制中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;冷紅梅

(一)技術領域

本發明涉及一組檢測甲型H1N1流感病毒抗藥性突變的特異性擴增引物和熒光探針及其應用，以及檢測甲型H1N1流感病毒抗藥性突變的方法。

(二)背景技術

流感(流行性感冒)是由流感病毒引起的一種人、禽、畜共患的急性傳染病，其發病率、死亡率和造成的經濟損失位居各傳染病之首。奧司他韋(商品名：達菲)被廣泛用來作為流感的預防和治療，但流感病毒由于神經氨酸酶274位的組氨酸突變為酪氨酸而出現了顯著的奧司他韋耐藥性。目前建立了多種利用分子生物學方法檢測具有奧司他韋耐藥性基因型流感病毒的方法，如單核苷酸多態性分析、滾環擴增技術以及Sanger測序等，但這些方法不僅費時、費力、比較昂貴，而且還會由于實驗室、工作人員、操作方法和標本的不同而影響其敏感性和特異性。

(三)發明內容

本發明目的是提供一組檢測甲型H1N1流感病毒抗藥性突變的特異性擴增引物和熒光探針及其應用，以及檢測甲型H1N1流感病毒抗藥性突變的方法。

本發明采用的技術方案是：

一種檢測甲型H1N1流感病毒抗藥性突變的特異性擴增引物和熒光探針，所述特異性擴增引物序列如下：

PN1H274Y-F：5’-AGGCCTCATACAAGATCTTCAGAATA-3’

PN1H274Y-R：5’-AAGACACCCACGGTCGATTC-3’

該引物與甲型流感病毒神經氨酸酶274位點編碼序列兩端互補，其擴增片段的長度為168bp；

所述熒光探針序列如下：

PN1H274-Pb1：5’-HEX-ATGCCCCTAATTATCACTA-MGBNFQ-3’

PN1H274Y-Pb2：5’-FAM-AATGCCCCTAATTATTACTA-MGBNFQ-3

探針的5’端標記熒光基團HEX或FAM，3’端標記MGB，NFQ為熒光淬滅基團，突變位點位于探針的中部。基因擴增產物以臨床呼吸道分泌物總RNA為模板，通過實時逆轉錄PCR進行擴增。

所述的特異性擴增引物和熒光探針可用于制備檢測甲型H1N1流感病毒抗藥性突變的熒光PCR檢測試劑盒。所述試劑盒主要包括：PCR緩沖液、DNA聚合酶、逆轉錄酶、脫氧三磷酸核苷混合物、特異性擴增引物和熒光探針。

所述試劑盒中還包括ROX^TM均一化參比染料。

本發明還涉及一種檢測檢測甲型H1N1流感病毒抗藥性突變的方法，所述方法包括：

(1)提取樣品RNA；

(2)熒光PCR擴增檢測：取PCR緩沖液、DNA聚合酶、逆轉錄酶、脫氧三磷酸核苷混合物、ROX均一化參比染料、特異性擴增引物和熒光探針配成反應液，加入樣品RNA為模板進行擴增反應，反應條件為：42℃逆轉錄30min；95℃預變性2min；95℃，5s變性，55℃復性與延伸40s，收集FAM和HEX熒光，共40個循環；

所述特異性擴增引物序列如下：

PN1H274Y-F：5’-AGGCCTCATACAAGATCTTCAGAATA-3’

PN1H274Y-R：5’-AAGACACCCACGGTCGATTC-3’

所述熒光探針序列如下：

PN1H274-Pb1：5’-HEX-ATGCCCCTAATTATCACTA-MGBNFQ-3’

PN1H274Y-Pb2：

5’-FAM-AATGCCCCTAATTATTACTA-MGBNFQ-3’；

(3)結果分析：如果僅有HEX熒光積累而沒有FAM熒光積累，則表示樣品中存在H274基因型的甲型H1N1流感病毒，且未發生H274Y突變，為對奧司他韋敏感的病毒；如果有FAM熒光積累，則表示樣品中存在甲型H1N1流感病毒，且已發生H274Y突變，為對奧司他韋不敏感的病毒；如果沒有熒光出現，則表示樣品中不存在甲型H1N1流感病毒。

所述步驟(2)中PCR反應液(以TaKaRa一步法熒光定量RT-PCR試劑盒為例)每25μL組成如下：

2×One?Step?RT-PCR?Buffer????12.5μL

引物PN1H274Y-F???????????????0.4μM

引物PN1H274Y-R???????????????0.4μM

探針PN1H274-Pb1??????????????0.2μM

探針PN1H274Y-Pb2?????????????0.2μM

ROX^TM均一化參比染料??????????0.5μL