[發明專利]檢測甲型H1N1流感病毒抗藥性突變的引物和探針及方法

無效

• 申請號: 201010258889.5
• 申請日: 2010-08-20
• 公開（公告）號: CN101928787A
• 公開（公告）日: 2010-12-29
• 發明（設計）人: 陳寅;張嚴峻;盧亦愚;茅海燕;周敏
• 申請（專利權）人: 浙江省疾病預防控制中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;冷紅梅

1.一種檢測甲型H1N1流感病毒抗藥性突變的特異性擴增引物和熒光探針，其特征在于：

所述特異性擴增引物序列如下：

PN1H274Y-F：5’-AGGCCTCATACAAGATCTTCAGAATA-3’

PN1H274Y-R：5’-AAGACACCCACGGTCGATTC-3’

所述熒光探針序列如下：

PN1H274-Pb1：5’-HEX-ATGCCCCTAATTATCACTA-MGBNFQ-3’

PN1H274Y-Pb2：5’-FAM-AATGCCCCTAATTATTACTA-MGBNFQ-3’。

2.如權利要求1所述的特異性擴增引物和熒光探針在制備檢測甲型H1N1流感病毒抗藥性突變的熒光PCR檢測試劑盒中的應用。

3.如權利要求2所述的應用，其特征在于所述試劑盒主要包括：PCR緩沖液、DNA聚合酶、逆轉錄酶、脫氧三磷酸核苷混合物、特異性擴增引物和熒光探針。

4.如權利要求3所述的應用，其特征在于所述試劑盒中還包括ROX^TM均一化參比染料。

5.一種檢測檢測甲型H1N1流感病毒抗藥性突變的方法，所述方法包括：

(1)提取樣品RNA；

(2)熒光PCR擴增檢測：取PCR緩沖液、DNA聚合酶、逆轉錄酶、脫氧三磷酸核苷混合物、ROX均一化參比染料、特異性擴增引物和熒光探針配成PCR反應液，加入樣品RNA為模板進行擴增反應，反應條件為：42℃逆轉錄30min；95℃預變性2min；95℃，5s變性，55℃復性與延伸40s，收集FAM和HEX熒光，共40個循環；

所述特異性擴增引物序列如下：

PN1H274Y-F：5’-AGGCCTCATACAAGATCTTCAGAATA-3’

PN1H274Y-R：5’-AAGACACCCACGGTCGATTC-3’

所述熒光探針序列如下：

PN1H274-Pb1：5’-HEX-ATGCCCCTAATTATCACTA-MGBNFQ-3’

PN1H274Y-Pb2：5’-FAM-AATGCCCCTAATTATTACTA-MGBNFQ-3’；

(3)結果分析：如果僅有HEX熒光積累，則表示樣品中存在H274基因型的甲型H1N1流感病毒，且未發生H274Y突變，為對奧司他韋敏感的病毒；如果有FAM熒光積累，則表示樣品中存在甲型H1N1流感病毒，且已發生H274Y突變，為對奧司他韋不敏感的病毒；如果沒有熒光出現，則表示樣品中不存在甲型H1N1流感病毒。

6.如權利要求5所述的方法，其特征在于所述步驟(2)中PCR反應液每25μL組成如下：

2×One?Step?RT-PCR?Buffer?????12.5μL

引物PN1H274Y-F????????????????0.4μM

引物PN1H274Y-R????????????????0.4μM

探針PN1H274-Pb1???????????????0.2μM

探針PN1H274Y-Pb2??????????????0.2μM

ROX^TM均一化參比染料???????????0.5μL

TaKaRa?Ex?Taq^TM?HS????????????0.5μL

PrimeScript^TM?RT?Enzyme?Mix?????0.5μL

樣品RNA?????????????????????????5μL

DEPC水補足至25μL。