[發(fā)明專利]大豆耐低磷基因GmAPt的分子標(biāo)記方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010258526.1
• 申請(qǐng)日: 2010-08-20
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101921758A
• 公開(kāi)（公告）日: 2010-12-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 喻德躍;張丹;程浩
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/11
• 分類號(hào): C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標(biāo)代理有限公司 32200
• 代理人: 張素卿

一、技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明提供了大豆耐低磷基因GmAPt的分子標(biāo)記方法，屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，可用于大豆耐低磷分子標(biāo)記輔助選擇育種和種質(zhì)的分型鑒定。

二、背景技術(shù)

大豆是我國(guó)重要的糧食作物和油料作物。然而，三分之二的耕地缺磷是限制我國(guó)大豆生產(chǎn)的主要因素。因此，發(fā)掘大豆自身潛力，高效利用土壤潛在磷素資源是解決大豆缺磷的有效途徑。

盡管大豆磷效率的研究也已取得了一些進(jìn)展，但在磷高效基因型的篩選上存在很大的困難，主要是因?yàn)楹Y選指標(biāo)和篩選時(shí)期的難以確定。為了加快大豆耐低磷脅迫育種進(jìn)程，十分關(guān)鍵的問(wèn)題是大豆種質(zhì)耐低磷特性的準(zhǔn)確鑒定，育種學(xué)家通常通過(guò)田間篩選的方法來(lái)鑒定大豆種質(zhì)的耐低磷特性，然而，這些方法在對(duì)大的群體進(jìn)行選擇時(shí)，尤其對(duì)于磷效率這樣數(shù)量性狀具有一定的局限性。例如，數(shù)量性狀受環(huán)境的影響很大，一兩次的鑒定結(jié)果難以準(zhǔn)確可靠，多年多點(diǎn)鑒定又費(fèi)時(shí)費(fèi)力。因此，如何準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)單地對(duì)耐低磷性進(jìn)行鑒定一直是大豆耐低磷育種的難題之一。

近年來(lái)，隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，許多的研究者利用與磷效率QTL連鎖的標(biāo)記對(duì)耐低磷種質(zhì)進(jìn)行輔助選擇，這種方法在一定的程度上提高了選擇的速度，且操作簡(jiǎn)單，但是這些標(biāo)記都是大豆磷效率基因的連鎖標(biāo)記，因此準(zhǔn)確性一般較低。

基于大豆耐低磷基因本身開(kāi)發(fā)的功能分子標(biāo)記可以克服以上缺點(diǎn)，Zhang等利用連鎖分析和關(guān)聯(lián)分析相結(jié)合的方法對(duì)控制磷效率基因進(jìn)行精細(xì)定位，發(fā)現(xiàn)并圖位克隆了存在于第八染色體上的一個(gè)控制磷效率的主效基因(GmAPt)，將該基因在184分大豆材料中進(jìn)行測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)在GmAPt基因第一內(nèi)含子存在等位基因，即與不耐低磷的材料相比，耐低磷材料在第一內(nèi)含子存在著10bp的缺失。

三、發(fā)明內(nèi)容

技術(shù)問(wèn)題：本發(fā)明針對(duì)上述的情況，利用大豆GmAPt基因不同材料間在第一內(nèi)含子上存在著10bp的差異，獲得了GmAPt基因的一個(gè)基因標(biāo)記Indel_S170，利用這個(gè)標(biāo)記進(jìn)行大豆耐低磷種質(zhì)的分型鑒定可以保證92.9％以上的準(zhǔn)確率。

技術(shù)方案：

鑒定大豆耐低磷基因GmAPt的基因標(biāo)記引物為，

InDel_S170正向引物序列：CTTGAGATCACTACAACACACC

InDel_S170反向引物序列：GATAGAAGAAC?AACACAAAAAC

上述引物用于鑒定大豆耐低磷基因GmAPt的基因標(biāo)記方法為：

1、大豆材料基因組DNA的提取；

2、對(duì)大豆基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：EXTaq×Master?PCR?Mix?5μL，Primer(3pmol/L)2.0μL，模板DNA(約15ng/μL)2μL，滅菌雙蒸水1μL；反應(yīng)總量10μL.PCR反應(yīng)在MJResearch?PTC-200熱循環(huán)儀上進(jìn)行，反應(yīng)程序包括：94℃預(yù)變性5min，每個(gè)循環(huán)95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7min，12℃保存。

3、反應(yīng)產(chǎn)物在8％非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，用硝酸銀染色。電泳結(jié)果如果有302bp的單條譜帶，則為耐低磷材料；如果有312bp單條譜帶，則為不耐低磷大豆材料。

有益效果：本發(fā)明利用分子遺傳學(xué)及分子生物學(xué)的方法獲得一個(gè)大豆耐低磷基因GmAPt的功能分子標(biāo)記Inde1_S170，該標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)具體歸納如下：

(1)分型和鑒定新的大豆耐低磷材料，不僅可以進(jìn)一步研究耐低磷的分子和遺傳機(jī)制，同時(shí)也可以拓寬耐低磷育種的遺傳背景，選育出高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、耐逆性強(qiáng)的優(yōu)質(zhì)大豆品種。而傳統(tǒng)的鑒定方法不僅工作量大而且花費(fèi)的周期長(zhǎng)，利用本發(fā)明的標(biāo)記可以簡(jiǎn)單快速的鑒定大豆材料的耐低磷特性。

(2)本發(fā)明所獲得的基因標(biāo)記是依據(jù)GmAPt基因內(nèi)部產(chǎn)生的堿基缺失，因此不存在遺傳的交換，也不需要表型的進(jìn)一步驗(yàn)證。

(3)育種中一些耐低磷相關(guān)性狀的調(diào)查必須將植株收獲或?qū)χ仓暝斐蓚Σ拍苓M(jìn)行(例如，測(cè)定生物量、磷含量、酶活性等)，而利用本發(fā)明的標(biāo)記可在任何時(shí)期通過(guò)SSR標(biāo)記判斷其耐低磷性，為有效選育耐低磷大豆品種提供了技術(shù)。

四、附圖說(shuō)明

圖1大豆耐低磷基因GmAPt在不同磷效率特性材料中第一內(nèi)含子的序列比對(duì)圖2Indel_S170對(duì)供試14份材料的電泳檢測(cè)圖

五、具體實(shí)施方式

(1)供試材料