[發明專利]一種重組減蛋綜合癥病毒纖維蛋白抗原的制備方法

無效

• 申請號: 201010257827.2
• 申請日: 2010-08-12
• 公開（公告）號: CN101955950A
• 公開（公告）日: 2011-01-26
• 發明（設計）人: 李榮貴;李瑩;孫志豪;周立橋;李金華
• 申請（專利權）人: 青島大學;周立橋;李金華
• 主分類號: C12N15/34
• 分類號: C12N15/34;C12N15/70;C07K14/075;C07K1/22;C07K1/14
• 代理公司: 青島高曉專利事務所 37104
• 代理人: 隋臻瑋

技術領域：

本發明涉及一種重組減蛋綜合癥病毒纖維蛋白抗原的制備方法，制備該重組蛋白可應用于預防家禽減蛋綜合癥的基因工程疫苗，屬于農業生物技術領域。

背景技術：

減蛋綜合癥(Egg?Drop?Syndrome，EDS)是由減蛋綜合癥病毒(EDSV)引起的一種以產蛋雞產薄殼或無殼蛋，產蛋率嚴重下降為主要特癥的傳染病(殷震，1982)。1976年被Van?Eck首次報道，現已成為世界范圍內引起產蛋損失的主要原因之一；并于1977年根據其病毒粒子形態、化學組成、及復制特點等歸為血凝性禽腺病毒。該病毒被命名為Ⅲ群禽類腺病毒，是此群中的唯一成員，并且確定了其完整的EDSV核苷酸序列(McFerran等，1997)。我國于1986年-1990年證實許多雞場EDS-76血清陽性，1992年由李剛首次分離到病毒，之后，從發病雞群和其他禽類中分離到多株病毒(Prya等，2001)。目前該病已經成為世界范圍內引起產蛋損失的重要疾病之一，給養禽業造成了巨大的經濟損失。本病可使產蛋率下降10％-30％，最高達41％，蛋的破損率達38％-41％，不同年齡的雞均可感染，6-8月齡母雞處于發病高峰期，既可水平傳播，又可垂直傳播，給養雞業造成嚴重的經濟損失。

目前，本病尚無有效的治療方法，只能從加強管理、免疫、淘汰病雞等方面進行防治。在發病時，如有必要也可給抗菌藥物，以防混合感染或繼發感染。預防本病的關鍵是注射疫苗。目前對于雞減蛋綜合癥的防治措施主要是使用減蛋綜合癥的滅活疫苗。然而，用該病毒進行接種，作為滅活疫苗或減毒株，有很多的缺點。一方面，一些減毒活疫苗仍保留有一定的毒力，并且對于強毒株展示出的抗原覆蓋效果是有區別的。另一方面，滅活疫苗滅活劑對病毒抗原有影響，而且對不同的抗原成分影響不同。

腺病毒是(adenovirus)是一種沒有包膜的直徑為70～90nm的顆粒，其衣殼(capsid)呈規則的20面體結構，直徑約80-110nm。衣殼含有240個六聯體(hexon)、12個五聯體(penton)及12根纖毛(fiber)，12根纖毛以五聯體蛋白為基底由衣殼表面伸出，纖毛頂端形成頭節區(knob)，其中基底由纖維蛋白的N-末端組成，而頭節區則由纖維蛋白的C-末端組成。纖毛的頭節區可與動物細胞表面的病毒受體結合，在病毒感染細胞過程中起著非常重要的作用。因此，纖維蛋白的C-末端區域為其抗體封閉后，病毒就喪失了其感染細胞的能力。

本發明從一株減蛋綜合癥病毒的基因組中克隆了其纖維蛋白C-末端編碼基因，并建立了獲得該基因編碼重組蛋白的方法，為減蛋綜合癥基因工程疫苗的研制提供了一種新的途徑。

發明內容：

本發明的目的在于克服現有滅活疫苗生產技術的缺點，旨在提供一種利用DNA重組技術制備EDSV關鍵抗原的方法。利用該方法可以快速、簡便、制備大量重組蛋白，可應用于家禽減蛋綜合癥的預防。

為了實現上述發明目的，本發明的重組減蛋綜合癥病毒纖維蛋白抗原的制備方法為：首先利用PCR技術從EDSV基因組中克隆纖維蛋白C-末端的編碼基因并進行序列分析；然后將該基因克隆到表達載體pET-15b，轉化大腸桿菌(E.coliBL21(DE3))后構建工程菌，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導工程菌表達纖維蛋白C-末端；最后裂解工程菌細胞，離心分離其中的包含體，尿素溶解后，再用鎳離子敖和樹脂親和純化重組蛋白，稀釋復性，利用Western?blotting技術檢測重組蛋白的免疫原性。

步驟一，纖維蛋白C-末端基因克隆與序列分析，按照如下步驟操作：

根據分離病毒的基因組序列設計一對引物，

引物1：5’AAACATATGTCGAGCTCGGTACCTTTGACTTTGGC?3’，

引物2：5’AAACTCGAGTTATAAGGGAATGG?3’。

采用酚抽提法從感染EDSV的雞血細胞中提取總DNA，以該DNA為模板，按照94℃變性45s，56℃退火45s，72℃延伸1min，共進行30循環進行PCR擴增，將PCR產物直接克隆到pMD-18T載體上，構建pMD-18T-EDS，轉化大腸桿菌E.coli?DH5α，提取質粒，利用雙脫氧鏈終止法進行序列測定。從減蛋綜合癥病毒基因組中克隆纖維蛋白C-末端的編碼基因具有序列1所示的核苷酸序列。

序列1

ATGTCGAGCT?CGGTACCTTT?GACTTTGGCT?TATGATTCCA?CGGATTTTCA?GGTGACAGAA