[發明專利]一種重組減蛋綜合癥病毒纖維蛋白抗原的制備方法

無效

• 申請號: 201010257827.2
• 申請日: 2010-08-12
• 公開（公告）號: CN101955950A
• 公開（公告）日: 2011-01-26
• 發明（設計）人: 李榮貴;李瑩;孫志豪;周立橋;李金華
• 申請（專利權）人: 青島大學;周立橋;李金華
• 主分類號: C12N15/34
• 分類號: C12N15/34;C12N15/70;C07K14/075;C07K1/22;C07K1/14
• 代理公司: 青島高曉專利事務所 37104
• 代理人: 隋臻瑋

1.一種重組減蛋綜合癥病毒纖維蛋白抗原的制備方法，其特征在于：首先利用PCR技術從減蛋綜合癥病毒基因組中克隆纖維蛋白C-末端的編碼基因并進行序列分析；然后將該基因克隆到表達載體pET-15b，轉化大腸桿菌后構建工程菌，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導工程菌表達纖維蛋白C-末端；最后裂解工程菌細胞，離心分離其中的包含體，尿素溶解后，再用鎳離子敖和樹脂親和純化重組蛋白，稀釋復性，利用Western?blotting技術檢測重組蛋白的免疫原性。

2.根據權利要求1所述的一種重組減蛋綜合癥病毒纖維蛋白抗原的制備方法，其特征在于所述的纖維蛋白C-末端基因克隆與序列分析按照如下步驟操作：根據分離病毒的基因組序列設計一對引物：引物1：5’AAACATATGTCGAGCTCGGTACCTTTGACTTTGGC?3’，引物2：5’AAACTCGAGTTATAAGGGAATGG?3’，采用酚抽提法從感染減蛋綜合癥病毒的雞血細胞中提取總DNA，以該DNA為模板，按照94℃變性45s，56℃退火45s，72℃延伸1min，共進行30循環進行PCR擴增，將PCR產物直接克隆到pMD-18T載體上，構建pMD-18T-EDS，轉化大腸桿菌E.coli?DH5α，提取質粒，利用雙脫氧鏈終止法進行序列測定。

3.根據權利要求1所述的一種重組減蛋綜合癥病毒纖維蛋白抗原的制備方法，其特征在于所述的表達載體與工程菌的構建按照如下步驟操作：將pMD-18T-EDS與pET-15b用NdeI/Xho?I雙酶切，酶切產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，分別回收700bp目的片段和5.7kb的pET-15b，然后16℃連接過夜；將連接產物轉化到E.coliDH5α感受態細胞，挑取單菌落接種到含100μg/mL氨芐青霉素的LB培養基，37℃振蕩培養12h，提取質粒后用Nde?I/Xho?I雙酶切進行鑒定，獲得表達質粒pET-15b-EDS；將重組質粒轉化到E.coli?BL21(DE3)，用0.5mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導表達，然后SDS-PAGE電泳分析。

4.根據權利要求1所述的一種重組減蛋綜合癥病毒纖維蛋白抗原的制備方法，其特征在于重組減蛋綜合癥病毒纖維蛋白C-末端的純化按照如下步驟操作：挑取工程菌單菌落接種于LB液體培養基，37℃恒溫振蕩過夜培養；將過夜培養物按體積比為1∶20的比例倒入LB液體培養基，37℃恒溫振蕩培養3h；然后加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷使其終濃度為5mmol/L，37℃恒溫振蕩培養4h；將培養物低溫冷凍離心，8000rpm，20min；棄上清，加入結合緩沖溶液懸浮菌體，進行超聲波破碎；然后4℃，8000rpm，30min，保留沉淀即包含體；將包含體中加入W/V為2％的Triton?X-100，用攪拌器攪拌，超聲破碎，攪拌器繼續攪拌，低溫冷凍離心8000rpm，30min；再分別用W/V為2％，2.2％，2.4％，2.5％的Triton?X-100按上述方法洗滌，共洗滌4次，向最后洗滌的包含體沉淀中加入結合緩沖溶液配制的濃度為8mol/L的尿素，用磁力攪拌器攪拌，冷凍離心8000rpm，30min，保留上清；將尿素溶解包含體的上清上結合緩沖溶液配制的8mol/L尿素平衡的Ni敖合樹脂柱，先用10倍柱床體積的結合緩沖溶液配制的8mol/L尿素沖洗層析柱，再用2倍柱床體積的洗滌緩沖溶液配制的8mol/L尿素洗滌層析柱，最后用洗脫緩沖溶液配制的8mol/L尿素洗脫目的蛋白，收集流出液，流出液于4℃對蒸餾水透析過夜后，冷凍干燥；其中，結合緩沖溶液是20mmol/L?Tris.HCl，pH8.0，0.5mol/L?NaCl，5mmol/L咪唑；洗滌緩沖溶液是20mmol/L?Tris.HCl，pH8.0，0.5mol/LNaCl，100mmol/L咪唑；洗脫緩沖溶液是20mmol/L?Tris.HCl，pH8.0，0.5mol/L?NaCl，300mmol/L咪唑；所述LB液體培養基含氨芐青霉素濃度0.1g/L。

5.根據權利要求1所述一種重組減蛋綜合癥病毒纖維蛋白抗原的制備方法，其特征在于從減蛋綜合癥病毒基因組中克隆纖維蛋白C-末端的編碼基因具有序列表中序列1所示的核苷酸序列。

6.根據權利要求1所述一種重組減蛋綜合癥病毒纖維蛋白抗原的制備方法，其特征在于重組減蛋綜合癥病毒纖維蛋白抗原是纖維蛋白C-末端，具有序列表中序列2所示的氨基酸序列。

7.根據權利要求1所述一種重組減蛋綜合癥病毒纖維蛋白抗原的制備方法，其特征在于利用該方法制備的重組蛋白與感染了減蛋綜合癥病毒的雞血清具有明顯的免疫反應。