[發(fā)明專利]一種L-鳥氨酸-α-酮戊二酸鹽的制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010256510.7
• 申請(qǐng)日: 2010-08-18
• 公開（公告）號(hào): CN102373245A
• 公開（公告）日: 2012-03-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蘇建勇;鄭南華;張建宇
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海漢飛生化科技有限公司
• 主分類號(hào): C12P13/02
• 分類號(hào): C12P13/02;C12N11/02
• 代理公司: 上海科盛知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31225
• 代理人: 趙志遠(yuǎn)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種氨基酸鹽的制備方法，尤其是涉及一種L-鳥氨酸-α-酮戊二酸鹽的制備方法。

背景技術(shù)

L-鳥氨酸-α-酮戊二酸鹽是廣泛使用于醫(yī)藥保健的原料，是一種肌肉能量合劑，同時(shí)也能幫助加速生長(zhǎng)激素缺乏的孩子生長(zhǎng)和加速外傷患者的創(chuàng)傷愈合。

制備L-鳥氨酸-α-酮戊二酸鹽的方法主要是L-鳥氨酸與α酮戊二酸直接成鹽反應(yīng)后結(jié)晶。而由于L-鳥氨酸制備方法的不同，可以由不同途徑來(lái)制備L-鳥氨酸-α-酮戊二酸鹽。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)制備L-鳥氨酸的文獻(xiàn)報(bào)道很多，L-鳥氨酸的制備方法主要有三種：化學(xué)法、發(fā)酵法、酶解法。

化學(xué)法：目前工業(yè)上最常用的生產(chǎn)方法是采用化學(xué)水解L-精氨酸制備L-鳥氨酸，1966年shell?int.Rearsch采用丙稀酸和氰化鈉作為主要原料合成L-鳥氨酸。(GB1020492，1966)。

發(fā)酵法：用腸桿菌中的某些菌類如Escherichia?coli，Aerobacter?aerogenes，Proteusrettgeri和Proteus?mirabili的突變菌株，進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)L-鳥氨酸，發(fā)酵液中L-鳥氨酸最高為15mg/ml，(GB1098348，1968；US39668072，1972)，Shibuya等利用Arthrobacter?citreus23-2A的突變株發(fā)酵生產(chǎn)L-鳥氨酸，發(fā)酵72h，產(chǎn)率為35.2g/L。

酶解法：沈淑英等用糞鏈球菌ATCC8043，糞產(chǎn)堿桿菌ATCC21400，糞鏈球菌S-43游離細(xì)胞轉(zhuǎn)化底物L(fēng)-精氨酸制備L-鳥氨酸，轉(zhuǎn)化率95-100％，提取收率為85-90％(天津微生物，1981，3：28-38)。1995年，M?Kyriakos等利用從動(dòng)物肝臟中提取的精氨酸酶水解L-精氨酸用于L-鳥氨酸鹽的制備(US5405761，1995)。

因?yàn)樯鲜鯨-鳥氨酸酶法生產(chǎn)過(guò)程都是利用游離細(xì)胞轉(zhuǎn)化底物L(fēng)-精氨酸，所以轉(zhuǎn)化液中會(huì)含有少量菌體蛋白和其他雜質(zhì)，不利于產(chǎn)物的分離純化；且轉(zhuǎn)化要去除菌體，降低產(chǎn)物得率，導(dǎo)致生產(chǎn)成本增加。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種操作簡(jiǎn)單、精氨酸轉(zhuǎn)化率高、產(chǎn)量高的固定化酶生產(chǎn)L-鳥氨酸-α-酮戊二酸鹽的方法。

本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：

一種L-鳥氨酸-α-酮戊二酸鹽的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

(1)固定化酶的制備

取三乙醇胺陰離子苯乙烯樹脂，用碳酸鉀溶液浸泡6-18h后過(guò)濾，再將濾出的三乙醇胺陰離子苯乙烯樹脂與碳酸鉀、溴化氫按重量比為1∶(0.1-0.6)∶(0.2-0.5)配制成溶液，于冰浴中反應(yīng)5-60min，調(diào)節(jié)pH值至7-10，再加入精氨酸酶，使其與三乙醇胺陰離子苯乙烯樹脂的重量比為(0.002-0.01)∶1，于1-10℃反應(yīng)12-48h，洗滌后用飽和食鹽水浸泡0.5-3h，再利用去離子水洗凈至溶液中檢測(cè)不出氯離子，即得固定化酶，保存于水中；

(2)轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化

將步驟(1)中制得的固定化酶與精氨酸、乙酸錳按重量比1∶(1-3)∶(0.004-0.02)混合，加入去離子水中，攪拌，采用乙酸調(diào)節(jié)pH值至9.0-9.4，在35-40℃下，反應(yīng)15-18h得固定化酶混懸液；

(3)產(chǎn)物提取及精制

將步驟(2)中的固定化酶混懸液過(guò)濾后，向?yàn)V液中加α酮戊二酸、活性炭，于20℃以下攪拌反應(yīng)5-30min后，過(guò)濾，加入醇類，攪拌0.5-1h，析出L-鳥氨酸-α-酮戊二酸鹽，攪拌3-5h，控溫至20℃以下、離心、干燥即得產(chǎn)品。

所述步驟(1)中的溶液中含三乙醇胺陰離子苯乙烯樹脂的重量百分濃度為40-60g/ml。

所述步驟(1)中的碳酸鉀為摩爾濃度1-5M的溶液，所述的溴化氫為重量百分濃度1-4g/ml的溶液，所述的精氨酸酶為重量百分濃度1-4g/L的溶液。

所述步驟(1)中調(diào)節(jié)pH采用摩爾濃度為0.05-2M的碳酸氫鈉溶液。

所述步驟(1)中洗滌過(guò)程是依次利用體積為100-400ml，濃度為0.05-0.3M的碳酸氫鈉溶液、0.5-4M的氯化鈉溶液及去離子水洗滌2-5次。

所述步驟(2)中攪拌反應(yīng)的攪拌速度為70-80rpm，反應(yīng)終點(diǎn)利用高效液相(HPLC)控制。

所述步驟(3)中加入α酮戊二酸量為：[(精氨酸量×0.96)×133/174]-(調(diào)pH所用的乙酸量)，活性炭的加入量為2-5g/100ml濾液。