[發(fā)明專利]一種表達(dá)faeG的基因工程益生菌的構(gòu)建方法及用途

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010256198.1
• 申請(qǐng)日: 2010-08-17
• 公開（公告）號(hào): CN102031262A
• 公開（公告）日: 2011-04-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐子偉;劉淑杰;李永明;王一成
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號(hào): C12N15/31
• 分類號(hào): C12N15/31;C12N15/63;C12N1/21;A61K39/108;A61P1/12;A61P31/04;C12R1/46;C12R1/225
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 周烽

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于畜牧獸醫(yī)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種表達(dá)產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌粘附素基因faeG的基因工程益生菌構(gòu)建及其在預(yù)防仔豬大腸桿菌性腹瀉中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

由產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(Enterotoxigenic?Escherichia?coli，ETEC)引起的仔豬腹瀉，對(duì)養(yǎng)豬生產(chǎn)構(gòu)成嚴(yán)重威脅，養(yǎng)豬業(yè)每年因此而遭受巨大的經(jīng)濟(jì)損失。仔豬大腸桿菌性腹瀉包括哺乳仔豬腹瀉和斷奶仔豬腹瀉。哺乳仔豬大腸桿菌性腹瀉又分為仔豬黃痢和白痢。仔豬黃痢是初生仔豬常發(fā)的急性、致死性傳染病，主要發(fā)生于7日齡以內(nèi)的乳豬，1～3日齡的乳豬多發(fā)，發(fā)病后以排黃色或黃白色稀便為特征。豬群一旦發(fā)病，很快傳播開來，一窩仔豬中的發(fā)病率可達(dá)50％～100％，死亡率有的可達(dá)100％。仔豬白痢多發(fā)于10～30日齡的哺乳仔豬，以排灰白色有腥臭味的漿糊樣稀便，嚴(yán)重的可排水樣稀便為特征。仔豬斷奶后大腸桿菌性腹瀉多發(fā)生于斷奶后1周，癥狀雖不像出生時(shí)那么明顯，但常減慢仔豬增重速度，其它因素如斷奶應(yīng)激、食物的改變等都會(huì)加重病情。

當(dāng)仔豬感染ETEC后，ETEC菌毛與小腸粘膜上皮的特異性受體結(jié)合，使得ETEC在小腸內(nèi)定居，大量繁殖，產(chǎn)生耐熱腸毒素(heat-stable?enterotoxin，ST)或/和不耐熱腸毒素(heat-labile?enterotoxin，LT)。腸毒素侵入小腸上皮細(xì)胞內(nèi)，改變上皮細(xì)胞的正常吸收和分泌，擾亂小腸代謝，使水、電解質(zhì)大量進(jìn)入小腸腔，從而引起劇烈腹瀉。在這個(gè)過程中，菌毛和腸毒素被認(rèn)為是主要的毒力因素，其中菌毛與小腸上皮結(jié)合是感染的首要步驟，也是致病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。不同ETEC菌株的菌毛抗原類型不同，主要有F4(K88)、F5(K99)、F6(987P)和F41等，在我國(guó)最常見的是K88。

對(duì)于哺乳仔豬大腸桿菌性腹瀉的預(yù)防，目前已有商業(yè)化疫苗可供選擇，主要有F4(K88)-F5(K99)二價(jià)苗和大腸桿菌滅活苗。用這些疫苗免疫妊娠后期母豬，會(huì)在母豬體內(nèi)產(chǎn)生特異性抗體，仔豬通過吮吸初乳獲得母源抗體，從而阻止產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌在腸內(nèi)定居，避免疫病發(fā)生；但現(xiàn)有商業(yè)化疫苗對(duì)仔豬斷奶后大腸桿菌性腹瀉卻難以奏效。此外，商業(yè)化的大腸桿菌滅活苗或大腸桿菌基因工程苗，因細(xì)菌胞壁含有脂多糖(內(nèi)毒素)毒性成分，接種動(dòng)物時(shí)會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的副反應(yīng)。

F4菌毛的生物合成和組裝至少與FaeA-FaeJ?10個(gè)蛋白亞基有關(guān)。其中FaeG含量最多，系組成菌毛的主要亞基，與菌毛的粘附特性有關(guān)，是F4受體的主要結(jié)合位點(diǎn)。乳桿菌和乳球菌被視為公認(rèn)安全(GRAS)的微生物，細(xì)胞壁不含脂多糖(內(nèi)毒素)毒性成分，以其為受體菌構(gòu)建表達(dá)產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌粘附素基因faeG的基因工程益生菌，用于預(yù)防仔豬大腸桿菌性腹瀉，具有廣闊前景。目前國(guó)內(nèi)在該領(lǐng)域的研究尚屬空白。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種表達(dá)faeG(產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌粘附素基因)的基因工程益生菌的構(gòu)建方法及用途，本發(fā)明免疫原性好、具有佐劑效應(yīng)、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、副作用小、制備簡(jiǎn)便。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：一種表達(dá)faeG的基因工程益生菌的構(gòu)建方法，該方法包括以下步驟：

(1)獲得大腸桿菌粘附素FaeG基因：以產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌C83907質(zhì)粒DNA為模板，設(shè)計(jì)合成含有Nco?I和Xba?I酶切位點(diǎn)的上下游引物P1和P2，上下游引物P1和P2分別具有SEQ?ID?NO.4和SEQ?ID?NO.5的基因序列。采用PCR方法擴(kuò)增faeG目的基因片段。將擴(kuò)增的faeG目的基因片段與pMD18-T載體連接，得重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸桿菌TOP10中，該重組質(zhì)粒命名為pMD-faeG，其具有SEQ?ID?NO.1所示的基因序列。

(2)構(gòu)建重組表達(dá)載體pNZ8148-faeG：將表達(dá)載體質(zhì)粒pNZ8148和pMD-faeG用限制性內(nèi)切酶Nco?I和Xba?I雙酶切，純化回收雙酶切載體片段和目的片段。目的片段和雙酶切載體片段連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli?MC1061，提取重組質(zhì)粒，命名為pNZ8148-fae?G，其具有SEQ?ID?NO.2所示的基因序列。

(3)構(gòu)建表達(dá)大腸桿菌粘附素基因faeG的重組乳酸乳球菌：采用電轉(zhuǎn)化方法將重組質(zhì)粒pNZ8148-faeG轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞L.lactis?NZ9000，利用氯霉素對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選，得重組菌，命名為NZ9000/8148-faeG，其具有SEQ?ID?NO.3所示的基因序列。