[發(fā)明專利]一種表達(dá)faeG的基因工程益生菌的構(gòu)建方法及用途

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010256198.1
• 申請(qǐng)日: 2010-08-17
• 公開（公告）號(hào): CN102031262A
• 公開（公告）日: 2011-04-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐子偉;劉淑杰;李永明;王一成
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號(hào): C12N15/31
• 分類號(hào): C12N15/31;C12N15/63;C12N1/21;A61K39/108;A61P1/12;A61P31/04;C12R1/46;C12R1/225
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 周烽

1.一種表達(dá)faeG的基因工程益生菌的構(gòu)建方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

(1)獲得大腸桿菌粘附素FaeG基因：以產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌C83907質(zhì)粒DNA為模板，設(shè)計(jì)合成含有Nco?I和Xba?I酶切位點(diǎn)的上下游引物P1和P2，上下游引物P1和P2分別具有SEQ?ID?NO.4和SEQ?ID?NO.5的基因序列。采用PCR方法擴(kuò)增faeG目的基因片段。將擴(kuò)增的faeG目的基因片段與pMD18-T載體連接，得重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸桿菌TOP10中，該重組質(zhì)粒命名為pMD-faeG，其具有SEQ?ID?NO.1所示的基因序列。

(2)構(gòu)建重組表達(dá)載體pNZ8148-faeG：將表達(dá)載體質(zhì)粒pNZ8148和pMD-faeG用限制性內(nèi)切酶Nco?I和Xba?I雙酶切，純化回收雙酶切載體片段和目的片段。目的片段和雙酶切載體片段連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli?MC1061，提取重組質(zhì)粒，命名為pNZ8148-fae?G，其具有SEQ?ID?NO.2所示的基因序列。

(3)構(gòu)建表達(dá)大腸桿菌粘附素基因faeG的重組乳酸乳球菌：采用電轉(zhuǎn)化方法將重組質(zhì)粒pNZ8148-faeG轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞L.lactis?NZ9000，利用氯霉素對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選，得重組菌，命名為NZ9000/8148-faeG，其具有SEQ?ID?NO.3所示的基因序列。

(4)大腸桿菌粘附素FaeG在乳酸乳球菌中的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE、Westernblot分析：挑取重組菌NZ9000/8148-faeG接種于含有10mg/mL氯霉素的GM17液體培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)物以3％的比例轉(zhuǎn)接于500ml含氯霉素GM17培養(yǎng)液中，培養(yǎng)至OD₆₀₀＝0.5～0.6時(shí)，加入誘導(dǎo)劑nisin，使其終濃度為5ng/ml，繼續(xù)培養(yǎng)3h。

2.一種權(quán)利要求1所述表達(dá)產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌粘附素基因faeG的基因工程益生菌在預(yù)防哺乳仔豬和斷奶仔豬大腸桿菌性腹瀉中的應(yīng)用。