[發明專利]甲型流感病毒耐藥位點檢測試劑盒及其制備與使用

無效

• 申請號: 201010255791.4
• 申請日: 2010-08-17
• 公開（公告）號: CN102373295A
• 公開（公告）日: 2012-03-14
• 發明（設計）人: 朱旭平;邵俊斌;劉燕;朱勤瑋
• 申請（專利權）人: 上海之江生物醫藥科技有限公司;上海之江生物科技有限公司;杭州博康生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 上海光華專利事務所 31219
• 代理人: 許亦琳;余明偉

技術領域

本發明涉及一種甲型流感病毒耐藥位點檢測試劑盒及其制備方法與使用。

背景技術

甲型流感病毒為常見流感病毒，根據H和N抗原不同，甲型流感病毒又分為許多亞型，H可分為15個亞型(H1～H15)，N有9個亞型(N1～N9)。甲型流感病毒最容易發生變異，流感大流行就是甲型流感病毒出現新亞型或舊亞型重現引起的。流感的特點是經常性的，不可預測的局部流行和罕見的全球大流行。1889年以來已出現幾次由甲型流感病毒抗原變異導致的世界性大流行。流感流行伴隨著死亡率的增加。在美國1972-1995年的流感流行研究中，23年中有19年發生流感流行并造成超額死亡。在11次不同的流感流行中，估計每次都有2萬例與流感有關的死亡，其中6次超過4萬例。

達菲(Tamiflu)，其通用名稱為磷酸奧司他韋(Oseltamivir?phosphate)，是羅氏制藥獨家生產的抗流感藥物。奧司他韋(Oseltamivir)于1999年在瑞士上市，2001年10月在我國上市。達菲是一種非常有效的流感治療用藥，并且可以大大減少并發癥(主要是氣管與支氣管炎、肺炎、咽炎等)的發生和抗生素的使用，因而是目前治療流感的最常用藥物之一，也是公認的抗禽流感病毒H5N1、甲型H1N1病毒最有效的藥物之一。目前已有很多國家在大規模的囤積達菲，用來應對人群中流感的威脅。然而，隨著達菲在治療人感染甲型流感病毒中的廣泛使用，出現了很多對達菲耐藥的現象，甚至出現了對達菲呈抗藥性的甲流死亡病例。從香港2008年1月到6月的監控數據看，在697例檢測樣本中有87例(占12.5％)樣本檢測為奧司他韋(達菲)耐藥性。這87例樣本都帶有神經氨酸酶NA基因H274Y突變。

因此在使用達菲治療前或治療后，對甲型流感病毒進行耐藥位點(H274Y)檢測，對于指導臨床用藥和判定有非常重要的意義。目前檢測基因位點突變的金標準是基因測序，該方法需要昂貴的檢測設備，且操作周期較長，一般需要2-3天才能出結果，不便于國內大多數醫院的開展和推廣。近年來，以熒光定量PCR為代表的基因擴增技術迅速發展，它具有快速、特異性、靈敏度高、成本相對低等優點，被廣泛應用于臨床檢測的各個方面。

發明內容

本發明的目的是提供一種檢測甲型流感病毒進行耐藥位點(H274Y)的試劑盒及其制備方法及使用方法。

本發明的技術方案：

一種甲型流感病毒耐藥位點檢測試劑盒，包括RT-PCR酶、陽性對照及陰性對照、引物、探針、RT-PCR?MIX及水。

試劑盒中，所述各組分分別獨立包裝；或者也可以將引物、探針、RT-PCR?MIX及水先混合配制IFVA(Influenza?viruses?A)-H274Y熒光PCR檢測混合液后包裝，再將其余組分分別獨立包裝。為了試驗方便，優選第二種方式。

所述甲型流感病毒耐藥位點為神經氨酸酶NA基因H274Y突變位點。

所述RT-PCR?MIX為dNTP、PCR?buffer和MgCl₂的混合物，為成熟商品，可經市場途徑購得。

所述陽性對照品可以為基因工程構建的含神經氨酸酶NA基因H274Y突變的質粒稀釋品。所述陽性對照中質粒的濃度為1×10³copies/ml-1×10⁷copies/ml。

所述質粒中含有序列與IFVA-H274Y熒光PCR檢測混合液中引物對應H274Y突變NA基因的擴增片段序列相同的多核苷酸。所述質粒可以為本領域熟知的細菌質粒或酵母質粒。

本發明所指H274Y突變NA基因是指發生了H274Y突變的神經氨酸酶NA對應的完整基因。

所述陰性對照可以為DEPC-H₂O。DEPC-H₂O即為DEPC處理水，是用DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)處理過并經高溫高壓消毒的純水，不含RNase、DNase和proteinase。可以用于RNA沉淀的溶解，含有RNA的各種反應體系如反轉錄、siRNA的退火等，以及其它各種要求無RNase、DNase和proteinase的反應體系。DEPC處理水的制備為已知技術。