[發明專利]甲型流感病毒耐藥位點檢測試劑盒及其制備與使用

無效

• 申請號: 201010255791.4
• 申請日: 2010-08-17
• 公開（公告）號: CN102373295A
• 公開（公告）日: 2012-03-14
• 發明（設計）人: 朱旭平;邵俊斌;劉燕;朱勤瑋
• 申請（專利權）人: 上海之江生物醫藥科技有限公司;上海之江生物科技有限公司;杭州博康生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 上海光華專利事務所 31219
• 代理人: 許亦琳;余明偉

1.一種甲型流感病毒耐藥位點檢測試劑盒，包括RT-PCR酶、陽性對照、陰性對照、引物、探針、RT-PCR?MIX及水。

2.如權利要求1所述甲型流感病毒耐藥位點檢測試劑盒，其特征在于，所述各組分分別獨立包裝；或者也可以將引物、探針、RT-PCR?MIX及水先混合配制IFVA-H274Y熒光PCR檢測混合液后包裝，再將其余組分分別獨立包裝。

3.如權利要求1所述甲型流感病毒耐藥位點檢測試劑盒，其特征在于，所述甲型流感病毒耐藥位點為神經氨酸酶NA基因H274Y突變位點。

4.如權利要求1所述甲型流感病毒耐藥位點檢測試劑盒，其特征在于，所述陽性對照為基因工程構建的含神經氨酸酶NA基因H274Y突變的質粒稀釋品，所述陰性對照為DEPC-H₂O。

5.如權利要求4所述甲型流感病毒耐藥位點檢測試劑盒，其特征在于，所述質粒中含有序列與所述試劑盒中的引物對應H274Y突變NA基因的擴增片段序列相同的多核苷酸。

6.如權利要求1所述甲型流感病毒耐藥位點檢測試劑盒，其特征在于，所述引物包括IFVA上游引物與IFVA下游引物，所述IFVA上游引物在對應NA基因第601-822位區域中任意設計，所述IFVA下游引物在對應NA基因第826-1050位區域中任意設計，所述探針包含對應NA基因H274Y突變位點的堿基序列或其互補序列，在滿足上述條件的基礎上在對應H274Y突變NA基因中所設引物的擴增片段所對應的區域內任意設計。

7.如權利要求6所述甲型流感病毒耐藥位點檢測試劑盒，其特征在于，所述探針對應NA基因第800-850位區域中的片段。

8.如權利要求1所述甲型流感病毒耐藥位點檢測試劑盒，其特征在于，所述引物包括IFVA上游引物和IFVA下游引物，IFVA上游引物的序列為：tggacaggcctcatacaaga，IFVA下游引物的序列為：attcgagccatgccagttat，所述探針的序列為：cctcatagtaataa，所述探針5’端標記熒光報告基團，3’端標記非熒光淬滅基團。

9.如權利要求2所述甲型流感病毒耐藥位點檢測試劑盒，其特征在于，所述IFVA-H274Y熒光PCR檢測混合液中各組分的體積份數為：

上游引物????0.75

下游引物????0.75

探針????????0.05

RT-PCR?MIX??12.5

水??????????4.95。

10.如權利要求1-9任一所述甲型流感病毒耐藥位點檢測試劑盒的制備方法，選自以下任一：

方法一：

1)將引物、探針、RT-PCR?MIX及水按配比混勻制備IFVA-H274Y熒光PCR檢測混合液；

2)將IFVA-H274Y熒光PCR檢測混合液、RT-PCR酶、陽性對照品和陰性對照品分別獨包裝并裝配試劑盒；

方法二：

將引物、探針、RT-PCR?MIX、水、RT-PCR酶、陽性對照品和陰性對照品分別獨立包裝后裝配試劑盒。

11.如權利要求1-9任一所述甲型流感病毒耐藥位點檢測試劑盒的使用方法，包括下列步驟：

1)待測樣本提取RNA獲得待測樣本RNA提取液；

2)選自以下任一：

分別將待測樣本RNA提取液、陽性對照品及陰性對照品與IFVA-H274Y熒光PCR檢測混合液及RT-PCR酶混合并進行PCR擴增反應，獲得待測樣本、陽性對照品及陰性對照品的Ct值以供分析；

分別將待測樣本RNA提取液、陽性對照品及陰性對照品與引物、探針、RT-PCR?MIX、水及RT-PCR酶混合并進行PCR擴增反應，獲得待測樣本、陽性對照品及陰性對照品的Ct值以供分析。