[發明專利]一種雙啟動子可誘導可分泌型穿梭質粒及其構建方法

無效

• 申請號: 201010255590.4
• 申請日: 2010-08-17
• 公開（公告）號: CN101948865A
• 公開（公告）日: 2011-01-19
• 發明（設計）人: 樂科易;張培德
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C12N15/75
• 分類號: C12N15/75;C12N15/66;A61K48/00;A61P31/04;A61P31/10
• 代理公司: 上海世貿專利代理有限責任公司 31128
• 代理人: 嚴新德

技術領域：

本發明涉及生物工程領域，尤其涉及一種穿梭質粒，特別是一種雙啟動子可誘導可分泌型穿梭質粒及其構建方法。

背景技術：

生物工程領域中，為了有效表達克隆基因，常常需要進行表達載體的構建。大腸桿菌表達系統是基因工程研究中最常用的一種。它雖然不能如真核系統那樣進行翻譯后加工，但大腸桿菌其遺傳背景相對清楚，操作簡便、生長周期短、經濟安全，因此仍然是使用最廣泛、也是不可被替代的系統，在基因工程基礎研究和實際應用中成為不可缺少的重要工具。一些重要的外源基因在大腸桿菌中獲得了占菌體總蛋白30％甚至40％多的高效表達量。通常大腸桿菌表達載體應滿足以下要求：1、適用范圍要廣；2、基因表達量高；3、表達的產物容易純化；4、質粒穩定性要好。可是迄今為止還沒有一個表達載體能完全滿足上述要求。就表達基因的質粒載體來說，一般最好要符合下面的條件：1、表達載體要具有多拷貝或高拷貝性；2、最好具有可誘導的強啟動子；3、有強的轉錄終止序列；4、有最佳最有效的翻譯起始序列。而要是具有分泌表達則更具優越性，這樣表達蛋白可正確折疊，更具生物活性且產物可溶；而且表達的蛋白分泌到胞外，能方便分離純化。在這些系統中，枯草桿菌就具有這種功能，枯草桿菌還是一種非致病性微生物，對人畜無害，所以常被許多研究者作為表達系統加以應用。但是在實際應用過程中，枯草桿菌質粒的提取與轉化效率明顯不如常用的大腸桿菌。如果在大腸桿菌中進行DNA分子操作，顯得簡便易行，完成了基因操作后，再在枯草桿菌中進行外源蛋白的高效表達，表達產物分泌于胞外，可以較好的解決和克服大腸桿菌表達產生包涵體，需要變性復性的煩瑣操作。所以構建大腸桿菌-枯草桿菌穿梭表達分泌載體成為一個重要選擇[工業微生物，1989，19(1)：1-6；生物工程學報，2002，18(4)：438-4411；遺傳學報，2000，27(7)：647-6531]。上個世紀后期，許多科學工作者構建各類表達載體，以期能夠在大腸桿菌、或者在枯草桿菌、或者在大腸桿菌-枯草桿菌等不同的載體中同時高效表達基因。有的構建多功能啟動子同時啟動表達以提高表達水平等等。所有的研究目的只有一個，那就是千方百計以最小成本換取最大表達產量，以降低表達產物如生物醫藥產品的生產成本；或者大大減少研究開發的時間和成本。所以，公開發表有許多不同表達載體構建成功的報導，以滿足不同研究和生產目的的需要。這些表達載體進行融合表達、有的非融合表達、有的進行分泌型表達、有的帶純化標簽的表達等等。

本發明構建的表達載體符合上述條件。本發明以殺菌肽牛乳鐵蛋白、人源LL-37、溶菌酶等這些對宿主產生毒殺作用的蛋白作為報告基因進行操作，更有優越性。能夠克服其對宿主的毒殺作用，進行在原核生物中表達重要目的蛋白更具有實際意義。