[發(fā)明專利]一種雙啟動(dòng)子可誘導(dǎo)可分泌型穿梭質(zhì)粒及其構(gòu)建方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010255590.4
• 申請(qǐng)日: 2010-08-17
• 公開（公告）號(hào): CN101948865A
• 公開（公告）日: 2011-01-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 樂科易;張培德
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/75
• 分類號(hào): C12N15/75;C12N15/66;A61K48/00;A61P31/04;A61P31/10
• 代理公司: 上海世貿(mào)專利代理有限責(zé)任公司 31128
• 代理人: 嚴(yán)新德

1.一種雙啟動(dòng)子可誘導(dǎo)可分泌型穿梭質(zhì)粒，其特征在于：由一個(gè)PstI酶切的大腸桿菌pET-28a質(zhì)粒和一個(gè)PstI酶切的枯草桿菌pE194質(zhì)粒構(gòu)成，所述的酶切的大腸桿菌pET-28a質(zhì)粒上插入有溶菌酶-抗菌肽功能片段和抗菌肽基因，所述的溶菌酶-抗菌肽功能片段由溶菌酶和抗菌肽基因融合而成。

2.如權(quán)利要求1所述的一種雙啟動(dòng)子可誘導(dǎo)可分泌型穿梭質(zhì)粒，其特征在于：所述的抗菌肽基因的兩端設(shè)置有NdeI和XhoI酶切位點(diǎn)。

3.如權(quán)利要求1所述的一種雙啟動(dòng)子可誘導(dǎo)可分泌型穿梭質(zhì)粒，其特征在于：所述的溶菌酶-抗菌肽功能片段的兩端設(shè)置有KpnI和NheI酶切位點(diǎn)。

4.如權(quán)利要求1所述的一種雙啟動(dòng)子可誘導(dǎo)可分泌型穿梭質(zhì)粒，其特征在于：所述的抗菌肽基因?yàn)橐环N、或者任意兩種、或者兩種以上的殺菌功能肽氨基酸片段的組合，或者任意一個(gè)功能片段的重復(fù)串聯(lián)融合。

5.如權(quán)利要求4所述的一種雙啟動(dòng)子可誘導(dǎo)可分泌型穿梭質(zhì)粒，其特征在于：所述的抗菌肽基因?yàn)榕Ｈ殍F蛋白肽基因、或者人源殺菌肽基因、或者人源溶菌酶基因、或者天蠶素基因、或者蛙皮素基因、或者蜂毒素基因、或者人源抗菌肽LL-37基因。

6.如權(quán)利要求1所述的一種雙啟動(dòng)子可誘導(dǎo)可分泌型穿梭質(zhì)粒，其特征在于：所述的溶菌酶-抗菌肽功能片段中的溶葡球菌酶的酶切識(shí)別位點(diǎn)氨基酸序列為GGG。

7.權(quán)利要求1所述的一種雙啟動(dòng)子可誘導(dǎo)可分泌型穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于：包括一個(gè)在NdeI和XhoI位點(diǎn)酶切大腸桿菌pET-28a質(zhì)粒的步驟，在所述的酶切大腸桿菌pET-28a質(zhì)粒NdeI和XhoI酶切位點(diǎn)之間插入至少一個(gè)抗菌肽功能片段，還包括一個(gè)構(gòu)建啟動(dòng)子信號(hào)肽片段的步驟，在所述的啟動(dòng)子信號(hào)肽片段上依次設(shè)置有BglII、PstI、NheI、KpnI和BglII酶切位點(diǎn)，所述的啟動(dòng)子信號(hào)肽片段的序列如SEQID?NO：2所示，然后分別用BglII酶切啟動(dòng)子信號(hào)肽片段和大腸桿菌pET-28a質(zhì)粒，采用連接酶連接，形成一個(gè)插入有啟動(dòng)子信號(hào)肽片段的大腸桿菌pET-28a質(zhì)粒，還包括一個(gè)構(gòu)建溶菌酶-抗菌肽功能片段的步驟，在溶菌酶-抗菌肽功能片段的兩端分別設(shè)置有NheI和KpnI酶切位點(diǎn)，然后在插入有啟動(dòng)子信號(hào)肽片段的大腸桿菌pET-28a質(zhì)粒的NheI和KpnI位點(diǎn)酶切，插入溶菌酶-抗菌肽功能片段，采用連接酶連接，形成一個(gè)插入有溶菌酶-抗菌肽功能片段的大腸桿菌pET-28a質(zhì)粒，還包括一個(gè)在插入有溶菌酶-抗菌肽功能片段的大腸桿菌pET-28a質(zhì)粒的PstI位點(diǎn)酶切的步驟，在PstI位點(diǎn)酶切的枯草桿菌pE194質(zhì)粒，然后插入有溶菌酶-抗菌肽功能片段的大腸桿菌pET-28a質(zhì)粒，構(gòu)成本發(fā)明的雙啟動(dòng)子可誘導(dǎo)可分泌型穿梭質(zhì)粒。