[發明專利]一種含有OATP1B1啟動子和報告基因的重組質粒及篩選OATP1B1誘導劑的方法

無效

• 申請號: 201010252491.0
• 申請日: 2010-08-13
• 公開（公告）號: CN102373231A
• 公開（公告）日: 2012-03-14
• 發明（設計）人: 郭成賢;吳蘭香;張偉;周宏灝
• 申請（專利權）人: 中南大學
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12Q1/66;C12Q1/02;G01N21/64
• 代理公司: 長沙正奇專利事務所有限責任公司 43113
• 代理人: 盧宏

技術領域

本發明涉及一種通過激活孕烷受體(PXR)來調節其下游靶基因有機陰離子轉運體1B1表達的誘導劑篩選方法。

本發明還涉及含熒光報告基因的質粒。

背景技術

肝臟是生物轉化解毒的主要器官，在肝臟中存在多種類型的藥物轉運體，對于藥物的吸收、分布和排泄起重要作用，如多藥耐藥相關蛋白，乳腺癌耐藥蛋白，有機陰離子轉運多肽家族等。OATP1B1是有機陰離子轉運多肽家族中最為重要的成員，OATP1B1的編碼基因SLCO1B1不僅具有高度多態性，且已發現多個具有功能意義的突變型。目前已研究證實，OATP1B1除靶向轉運非結合型膽紅素、膽汁酸、甲狀腺激素等多種內源性物質外，還介導多種具有重要臨床意義藥物的肝臟跨膜轉運，如抗惡性腫瘤藥(伊立替康、甲氨喋呤)、調血脂藥(普伐他汀、阿托伐他汀、匹伐他汀、羅蘇伐他汀、西伐他汀)、抗高血壓藥(纈沙坦、奧美沙坦、波生坦)、抗高血糖藥(瑞格列奈、那格列奈)。OATP1B1功能增強(如被誘導)時，轉運底物的能力提高，進入肝細胞的底物數量增加；反之，OATP1B1功能降低(如某些位點的基因突變)時，進入肝細胞內的底物減少。因此OATP1B1功能改變不僅與膽紅素血癥有密切聯系，而且與藥物的療效和毒副作用緊密相關。全基因組關聯研究(Genome-wide?Association?Study，GWAS)表明OATP1B1功能缺陷的*5/*5基因突變者，轉運辛伐他汀進入肝細胞的功能降低，致使辛伐他汀轉運進肝細胞的數量減少、血漿藥物濃度過高，致使其降脂療效減弱而導致肌病等不良反應增加。因此，研究藥物對OATP1B1的誘導作用對于膽紅素血癥治療以及藥物安全合理應用有著重要的意義，見下表。

OATP1B1轉運藥物的毒副反應及解決方案等相關信息

原代培養的人肝細胞模型是經典的體外酶、轉運體誘導研究模型。然而，人肝細胞模型受到倫理道德、組織來源、培養條件、無法做到高通量等眾多限制，在實際研究中很少采用。因此，發明一種原材料易獲得、操作簡便、成本低廉、可實現高通量篩選的新方法應用在OATP1B1誘導劑的開發研究中顯得尤為重要。

發明內容

本發明的目的是提供一種高通量篩選OATP1B1誘導劑的方法.

本發明的另一目的是提供一種含有OATP1B1基因啟動子(-128to-111和-9957to-9940)和報告基因的重組質粒。

本發明首先提供一種含有OATP1B1啟動子和報告基因的重組質粒，所說的OATP1B1的啟動子區域是-128to-111和-9957to-9940。

其中本發明所述的含有OATP1B1基因啟動子和報告基因的重組質粒中所述報告基因可以為螢火蟲熒光素酶基因，氯霉素乙酰轉移酶、堿性磷酸化酶、β-半乳糖苷酶、綠色熒光蛋白、β-內酰胺酶等。每種熒光素酶都可以通過商業途徑獲得，也都各自有其特點。但總的來說，由于螢火蟲熒光素酶檢測靈敏度高，檢測容易等特點是目前最常用的作為啟動子研究的報告基因。

制備重組質粒的方法是已知的，例如由美國冷泉港實驗室出版社的《分子克隆實驗指南》詳細論述了重組質粒的制備方法。

本發明利用上面獲得的重組質粒，通過以下方法來實現的篩選化合物的，包括如下步驟：

第一步：將前述獲得的含有OATP1B1啟動子和報告基因的重組質粒、PXR表達質粒、以及內參質粒海腎熒光素酶共轉染至人肝癌細胞株HepG2細胞中；

第二步：加入待篩選的可能具有激活PXR調節OATP1B1基因表達的化合物；

第三步：采用化學發光檢測報告基因的表達以及海腎熒光素酶熒光，以二者的比值來反映不同的待篩選化合物對OATP1B1基因表達的影響。