[發明專利]一種農桿菌介導的小油桐基因轉化方法

有效

• 申請號: 201010252415.X
• 申請日: 2010-08-13
• 公開（公告）號: CN101948867A
• 公開（公告）日: 2011-01-19
• 發明（設計）人: 徐增富;潘竟麗;付乾堂
• 申請（專利權）人: 中國科學院西雙版納熱帶植物園
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H4/00;A01H5/00
• 代理公司: 云南協立專利事務所 53108
• 代理人: 謝嘉

1.一種農桿菌介導的小油桐基因轉化方法，其特征在于：以小油桐成熟種子的子葉切除其基部的1/3～1/4后的材料作為農桿菌感染的受體，轉化受體與農桿菌共培養后先接種在無篩選劑的培養基上進行愈傷誘導培養4周后，再繼代到選擇培養基上篩選抗性芽，以硫酸卡那霉素作為篩選劑，通過篩選獲得抗性芽，繼代培養獲得抗性植株，經分子檢測，獲得轉基因小油桐植株。

2.根據權利要求1所述的農桿菌介導的小油桐基因轉化方法，其特征在于具體包括以下步驟：

(1)種子滅菌和外植體準備：

取小油桐成熟的種子，剝去外種皮，置無菌水中浸泡10～12小時后用75％的酒精滅菌30秒，無菌水沖洗2～3次，然后用0.8％～1.0％次氯酸鈉溶液處理10分鐘，無菌水沖洗3～4次，放置在無菌濾紙上除去多余的水分；取出胚，切除胚軸端1/3～1/4長度的子葉，剩余子葉部分作為外植體備用；

(2)外植體與農桿菌共培養和轉化

挑取含有pCAMBIA?2301質粒的農桿菌單克隆于含有50mg/L卡那霉素和25mg/L鏈霉素的YEP液體培養基中進行活化培養，在28℃下200rpm振蕩培養12小時，轉接并二次活化農桿菌，菌液濃度至OD₆₀₀＝0.4～0.8，在4℃下4000rpm離心5分鐘收集菌體，棄上清，用無菌液體MS基礎培養基懸浮菌體至OD₆₀₀＝0.4待用；

取制備好的子葉外植體置上述農桿菌菌液中，在28℃，150～200rpm搖床振蕩培養20分鐘，將浸染過的子葉外植體置無菌的濾紙上吸去多余的菌液，接種在共培養培養基MS-Jc1上暗培養3天；所述的共培養培養基MS-Jc1包括下述組份：MS基礎培養基附加6-BA?3mg/L，IBA?0.01mg/L，蔗糖30g/L和瓊脂7g/L，pH5.8；

(3)外植體的愈傷誘導培養

共培養后的外植體材料用液體抑菌培養基MS-Jc1+500mg/L頭孢霉素，洗去多余的菌，于濾紙上吸干材料表面的的液體，接種在不含篩選劑的含300mg/L頭孢霉素的固體MS-Jc1抑菌培養基上，在12h光照/12h黑暗、溫度為26±2℃條件下進行愈傷誘導培養4周；

(4)抗性芽的篩選

愈傷誘導培養2～4周后，將培養材料繼代至篩選培養基中培養，繼續培養1～3周后將在子葉基部生長出抗性芽；所述的篩選培養基包括下述組份：MS-Jc1+300mg/L頭孢霉素+15～25mg/L硫酸卡那霉素；

(5)抗性芽的生根

抗性芽長至1.5～2cm高時，從愈傷塊上切下，轉接至生根誘導培養基上誘導生根，所述的生根誘導培養基RIM包括下述組份：1/2MS基礎培養基，IBA0.1～0.2mg/L，NAA?0.1～0.2mg/L，頭孢霉素100mg/L，硫酸卡那霉素20mg/L和蔗糖1.0％；

(6)轉基因植株的分子生物學方法鑒定

取所獲得的抗性再生植株的葉片，采用PCR和Southern雜交等分子生物學方法進行轉入基因的檢測，或進行轉入基因的蛋白質產物活性檢測。

3.根據權利要求2所述的農桿菌介導的小油桐基因轉化方法，其特征在于：所述的各種植物培養基在制備時，均調pH至5.8，120℃高壓滅菌20min，當培養基溫度冷至40～50℃時，再添加頭孢霉素或硫酸卡那霉素，混勻分裝后備用。