[發明專利]一種農桿菌介導的小油桐基因轉化方法

有效

• 申請號: 201010252415.X
• 申請日: 2010-08-13
• 公開（公告）號: CN101948867A
• 公開（公告）日: 2011-01-19
• 發明（設計）人: 徐增富;潘竟麗;付乾堂
• 申請（專利權）人: 中國科學院西雙版納熱帶植物園
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H4/00;A01H5/00
• 代理公司: 云南協立專利事務所 53108
• 代理人: 謝嘉

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及小油桐轉基因技術，具體涉及一種通過農桿菌介導基因轉化技術獲得小油桐轉基因植株的方法方法。

背景技術

小油桐(Jatropha?curcas?L.)又名小桐子、麻瘋樹、膏桐等，屬大戟科(Euphorbiaceae)麻風樹屬(Jatropha)多年生灌木或小喬木，廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區，是一種多用途的樹種，在生物柴油、醫藥開發、生物農藥和肥料等方面具有良好地應用前景。其種子含油率一般在30～40％，是目前國際上公認的最具發展潛力的能源植物之一。但小油桐目前在世界各地種植的產量普遍太低，無法滿足生物柴油產業發展對原料的大量需求。由于木本植物的世代周期較長，采用常規的育種技術難以在較短的時間內選育出高產的新品種，因此，利用轉基因技術提高小油桐的產量就具有重要的現實意義。

近幾年來，國內外對小油桐的遺傳轉化進行了初步的研究，雖然已可以通過小油桐多種外植體，如真葉、葉柄、子葉、下胚軸和節等獲得小油桐的再生植株，但這些再生體系仍未能轉變為高效的轉化方法。Li等(2008，Plant?CellTissue?and?Organ?Culture，92：173-181)以子葉作為外植體通過農桿菌介導的轉化方法，用除草劑草銨膦作為篩選試劑首次獲得了轉基因小油桐，但轉化效率不高。He等(2009，Silvae?Genetica，58：123-128)和Mazumdar等(2010，South?African?Journal?of?Botany，76：337-344)嘗試用硫酸卡那霉素和潮霉素(Trivedi?et?al.，2009，International?Journal?of?Agriculture?Sciences1：11-20)作為篩選試劑，但只獲得了抗性的愈傷，無再生的轉基因植株。最近，Purkayastha等(2010，Biologia?Plantarum，54：13-20)用基因槍的方法也獲得了再生的轉基因植株。但基因槍轟擊存在一些問題，如外源基因往往是多拷貝隨機整合到受體基因組中，可能發生多種方式的重排，易造成轉錄或轉錄后水平的基因沉默，產生嵌合體等。農桿菌介導的轉化方法是外源基因自然轉移過程，外源基因能有效地整合到植物細胞染色體上，且大多數是單一位點整合，遺傳穩定性較好。探索一種既能利用農桿菌介導的基因轉化方法的優點又能提高小油桐轉化效率的方法，對小油桐的轉基因研究將起到很大的促進作用。

發明內容

本發明的目的在于克服現有小油桐轉基因技術的不足，提供一種以小油桐成熟種子的子葉為轉化受體、通過農桿菌介導的轉化方法獲得小油桐轉基因植株的方法。該方法采用含有pCAMBIA?2301質粒的農桿菌轉化小油桐子葉，獲得轉基因植株，為生產上轉化其他目的基因、獲得轉基因的小油桐優良株系提供有效的方法。

本發明的目的通過以下技術方案予以實現。

除非另有說明，本發明所采用的百分數均為重量百分數。

一種農桿菌介導的小油桐基因轉化方法，其特征在于：以小油桐成熟種子的子葉切除其基部的1/3～1/4后的材料作為農桿菌感染的受體，轉化受體與農桿菌共培養后先接種在無篩選劑的培養基上進行愈傷誘導培養4周后，再繼代到選擇培養基上篩選抗性芽，以硫酸卡那霉素作為篩選劑，通過篩選獲得抗性芽，繼代培養獲得抗性植株，經分子檢測，獲得轉基因小油桐植株。

一種農桿菌介導的小油桐基因轉化方法，包括以下步驟：

1、種子滅菌和外植體準備：

取小油桐成熟的種子，剝去外種皮，置無菌水中浸泡10～12小時后用75％的酒精滅菌30秒，無菌水沖洗2～3次，然后用0.8％～1.0％次氯酸鈉溶液處理10分鐘，無菌水沖洗3～4次，放置在無菌濾紙上除去多余的水分；取出胚，切除胚軸端1/3～1/4長度的子葉，剩余子葉部分作為外植體備用；

2、外植體與農桿菌共培養和轉化

挑取含有pCAMBIA?2301質粒的農桿菌單克隆于含有50mg/L卡那霉素和25mg/L鏈霉素的YEP液體培養基中進行活化培養，在28℃下200rpm振蕩培養12小時，轉接并二次活化農桿菌，菌液濃度至OD₆₀₀＝0.4～0.8，在4℃下4000rpm離心5分鐘收集菌體，棄上清，用無菌液體MS基礎培養基懸浮菌體至OD₆₀₀＝0.4待用；