[發明專利]淡紫擬青霉抑制象耳豆根結線蟲的測定方法

無效

• 申請號: 201010252116.6
• 申請日: 2010-08-12
• 公開（公告）號: CN102373260A
• 公開（公告）日: 2012-03-14
• 發明（設計）人: 卓侃;史懷;周先治;黃素芳
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院生物技術研究所;福建省農業科學院農業生物資源研究所
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02
• 代理公司: 福州市鼓樓區京華專利事務所(普通合伙) 35212
• 代理人: 翁素華

【技術領域】

本發明涉及一種微生物的測定方法，尤其涉及一種淡紫擬青霉抑制象耳豆根結線蟲的測定方法。

【背景技術】

根結線蟲(Meloidogyne?spp.)是一類危害極大的植物寄生線蟲，它廣泛分布于世界各地，世界每年由根結線蟲所引起經濟上重要農作物的損失占總損失的5％(孫龍華等，2005)。近年來，由于作物復種指數的提高和設施農業的發展，根結線蟲的發生和危害明顯加劇(蔣寒等，2003)。目前主要采用殺線蟲劑防治根結線蟲，但殺線蟲劑通常毒性較高，會增加環境的污染，因此越來越多的學者認識到控制根結線蟲必須采取綜合措施或采用以生物生態防治為核心的可持續治理系統(張紹升，1999)，而生物防治是其中的一個重要部分。

線蟲生物防治是指通過引入捕食線蟲和寄生于線蟲的生物，從而降低線蟲的群體，以便把線蟲引起的經濟損失減少到最低水平，或者通過生物所產生的毒素殺死線蟲的一種防治手段(馮志新，2001)。又由于淡紫擬青霉在我國分布廣，較易分離到，且對根結線蟲有很好的防治作用，因此我國學者對淡紫擬青霉進行了大量的研究。

【發明內容】

本發明所要解決的技術問題在于提供一種淡紫擬青霉抑制象耳豆根結線蟲的測定方法，不僅能實現生物防治根結線蟲，而且可避免對環境造成污染。

本發明是通過以下技術方案解決上述技術問題的：

技術方案之一

淡紫擬青霉抑制象耳豆根結線蟲卵孵化的測定方法，包括以下步驟：

(1)挑取純化后的象耳豆根結線蟲的卵囊，放入帶蓋的10mL離心管內，加入5mL0.5％NaClO，用力振蕩3min，迅速將其通過雙層篩，上層篩孔徑為250μm，下層篩孔徑為38μm，接著用無菌水收集沖洗下層篩中的卵粒；

(2)單孢分離的淡紫擬青霉菌株在25℃下生長7d后，用直徑為6mm的打孔器切取菌落邊緣的菌塊，將菌塊置于PDA培養基平板中央，在菌塊周圍斜插上3塊載玻片，每塊載玻片上放置約50粒卵；設置一個對照，該對照是直接把卵粒放置在載玻片上后，置于PDA培養基中；各重復3次，然后把它們均置于25℃培養箱中；

(3)分別在3d、7d和10d后取出載玻片鏡檢卵的孵化數，并通過計算卵的相對抑制率，同時每天觀察卵被菌寄生的情況。

技術方案之二

淡紫擬青霉抑制象耳豆根結線蟲2齡幼蟲的測定方法，包括以下步驟：

(1)挑取象耳豆根結線蟲卵囊置于25℃培養箱中，孵化獲得2齡幼蟲；

(2)單孢分離的淡紫擬青霉菌株在25℃下生長7d后，用直徑為6mm的打孔器切取菌落邊緣的菌塊，將菌塊移入裝有50mLPDB培養液的250mL三角瓶中，然后置于溫度為25℃、轉速為120rpm的搖床中培養7d，將培養所得真菌粗提液先經濾紙過濾第一次，濾去菌絲，接著再使用孔徑為0.2μm的微孔濾膜過濾第一次的濾液，最后獲得的第二次濾液即為所需的淡紫擬青霉培養濾液；設置一對照，該對照用未接菌的，且于溫度25℃、轉速120rpm搖床中培養7d的PDB培養液；

(3)取1mL步驟(2)中的培養濾液，加入0.5mL象耳豆根結線蟲2齡幼蟲懸浮液，該懸浮液濃度約為200條2齡幼蟲/mL，放入25℃培養箱培養24h，24h后取出于解剖鏡下采用針刺法觀察線蟲的活動性，不活動的線蟲即被擊倒的，將不活動線蟲挑入清水中，24h后觀察其死亡率，不動者即為死亡；

其中，步驟(2)中的PDB培養液的組分為：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，水1000mL。

本發明淡紫擬青霉抑制象耳豆根結線蟲的測定方法的有益效果在于：通過淡紫擬青霉素寄生于象耳豆根結線蟲從而對象耳豆根結線蟲起到抑制作用，實現生物防治根結線蟲，進而取代現有的利用殺線蟲劑防治根結線蟲的方法，避免了殺線蟲劑的毒性對環境造成的污染。

【附圖說明】

下面參照附圖結合實施例對本發明作進一步的描述。

圖1是本發明淡紫擬青霉抑制象耳豆根接線蟲卵孵化的測定方法流程圖。

圖2是本發明淡紫擬青霉抑制象耳豆根結線蟲2齡幼蟲的測定方法流程圖。

圖3a是本發明中淡紫擬青霉菌株寄生于象耳豆根結線蟲卵第3天時的細胞圖。

圖3b是本發明中淡紫擬青霉菌株寄生于象耳豆根結線蟲卵第5天時的細胞圖。

【具體實施方式】

本發明淡紫擬青霉抑制象耳豆根結線蟲的測定方法主要通過兩個技術方案實現的：

技術方案之一