[發(fā)明專利]海洋擬諾卡氏菌株HY-G及其產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010251259.5
• 申請(qǐng)日: 2010-08-12
• 公開（公告）號(hào): CN101942406A
• 公開（公告）日: 2011-01-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳少杰;馬桂珍;王淑軍;陳麗;焦豫良;王淑芳;暴增海
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 淮海工學(xué)院
• 主分類號(hào): C12N1/20
• 分類號(hào): C12N1/20;C12N9/42;C12R1/01
• 代理公司: 南京眾聯(lián)專利代理有限公司 32206
• 代理人: 劉喜蓮

1.一種海洋擬諾卡氏菌株HY-G(Nocardiopsis?sp.HY-G)CCTCC?NO：M?2010126。

2.一種如權(quán)利要求1所述的海洋擬諾卡氏菌株HY-G?CCTCC?NO：M2010126產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于：其步驟如下：

(1)發(fā)酵：采用搖瓶發(fā)酵法，在250mL三角瓶中加入100mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基，按照接種量為1％的比例接種海洋擬諾卡氏菌株HY-G的孢子懸液，孢子懸液的濃度為10⁶/mL；然后在23～38℃的培養(yǎng)溫度下、在60～120轉(zhuǎn)/分鐘的搖床轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)72h，得發(fā)酵液；

(2)粗酶液的制備：取上述發(fā)酵液在8000轉(zhuǎn)/分鐘下離心10分鐘，收獲菌體；菌體用0.01mol/L、pH?6.8的Tris-HCl緩沖溶液洗滌2次并離心后，加入適量的上述Tris-HCl緩沖溶液重新懸浮菌體，在0℃冰浴的條件下，用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎菌體細(xì)胞，得菌體破碎液；取菌體破碎液在12000轉(zhuǎn)/分鐘下離心20分鐘除去菌體碎片，所得上清液即為粗酶液。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的粗酶液采用以下方法進(jìn)行分離純化：

(1)取粗酶液，加入硫酸銨至40％飽和度，離心去除沉淀得上清液；用1.7mol/L硫酸銨溶于0.01mol/L、pH?6.8的Tris-HCl緩沖溶液中制成平衡緩沖溶液，然后用平衡緩沖溶液平衡Phenyl-Sepharose柱，再用平衡過的Phenyl-Sepharose柱吸附上清液中的蛋白，用含0.34mol/L硫酸銨的0.01mol/L、pH?6.8的Tris-HCl緩沖溶液洗脫去除雜蛋白，再用0.01mol/L、pH?6.8的Tris-HCl緩沖溶液洗脫得到初步純化的β-葡萄糖苷酶液；

(2)用0.01mol/L、pH?6.8的Tris-HCl緩沖溶液平衡DEAE-Sephrose柱，然后取初步純化的β-葡萄糖苷酶液用DEAE-Sephrose柱吸附，通過梯度洗脫得到純化的β-葡萄糖苷酶。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所得到的純化的β-葡萄糖苷酶采用以下方法進(jìn)一步純化：先用0.01mol/L、pH?6.8的Tris-HCl緩沖溶液平衡Superdex?200HR凝膠色譜柱；然后對(duì)純化的β-葡萄糖苷酶進(jìn)行透析處理后用Superdex?200HR凝膠色譜柱吸附，再用0.01mol/L、pH?6.8的Tris-HCl緩沖溶液洗脫，收集A₂₈₀最大吸收峰并檢測(cè)活性，活性組分即為進(jìn)一步純化的-葡萄糖苷酶。

5.一種如權(quán)利要求4所述的方法所述的β-葡萄糖苷酶，其特征在于：所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)為：所述擬諾卡氏菌HY-G產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶屬于胞內(nèi)酶，其分子量為43～45kDa；該酶在以p-NPG為底物時(shí)，測(cè)得在pH?6.0-9.0有酶活力，其中在pH?7.0-8.0時(shí)酶活力強(qiáng)；該酶在40-60℃下具有有酶活性；Fe²⁺、Mg²⁺、Pb²⁺、Na⁺、Fe³⁺對(duì)該酶活性有促進(jìn)作用，其中Fe²⁺、Fe³⁺促進(jìn)作用強(qiáng)，Ca²⁺、Zn²⁺、Ag⁺、Cu²⁺、K⁺對(duì)該酶活性有抑制作用，其中Zn²⁺、Ag⁺、Cu²⁺抑制作用強(qiáng)。