[發明專利]牛子宮內膜炎病原快速診斷方法

無效

• 申請號: 201010250097.3
• 申請日: 2010-08-11
• 公開（公告）號: CN101906478A
• 公開（公告）日: 2010-12-08
• 發明（設計）人: 張乃生;郭夢堯;王國卿;楊正濤;王海霞
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司 22100
• 代理人: 魏征驥

技術領域

本發明屬于牛子宮內膜炎病原診斷方法。

背景技術

子宮內膜炎是牛產后多發的繁殖障礙性疾病，世界各地該病的發病率都很高，如在韓國奶牛子宮內膜炎的發病率為47.6％，美國為53％，中國為20-50％。此疾病影響奶牛的產奶量、繁殖率，甚至因長期不孕而被淘汰，造成巨大的經濟損失。目前對于本病的發生機理還不十分明了，由于環境、生產條件的因素的影響，本病的致病菌診斷結果各國均不同，為本病的治療帶來了困難。因此，快速、有效地病原診斷方法成為了對此疾病的研究關鍵。

牛子宮內膜炎是多種病原導致的。從感染子宮中分離出的病原微生物，大部分存在環境中，并具有感染其他組織和器官的能力。因此子宮內膜炎是非特異性病原菌感染。目前對于本病的病原診斷，主要為傳統細菌分離鑒定方法。首先分離培養微生物，然后進行鑒定，再進行藥敏試驗等研究。但微生物的分離存在偶然性，與培養基密切相關，會導致很多遺漏，況且分離到的也未必是主要致病菌。而且從感染的子宮中分離到的許多細菌也是隨意組合的，再次感染時，子宮中的菌群組合會稍有改變，無法保證子宮內菌群組合的真實比例關系。另外存在感染或者其他需氧菌時，子宮內氧還原酶的電位降低，創造一個缺氧的環境，有大量的厭氧菌繁殖。傳統的致病菌分離培養技術對于大部分厭氧細菌是無法分離培養的。因此，傳統診斷方法不能揭示患病奶牛子宮內微生物的狀態，無法對致病菌做出有效的診斷，導致疾病缺乏有效的防治措施。

發明內容

本發明提供一種牛子宮內膜炎病原快速診斷方法，以解決傳統診斷方法不能揭示患病奶牛子宮內微生物的狀態，無法對致病菌做出有效的診斷的問題。本發明采取的技術方案是，包括下列步驟：

(一)病料的采集

利用子宮內膜活檢采樣器進行子宮樣品的采集，采集后將棉拭子放入含2ml滅菌生理鹽水2ml的凍存管內以制成菌體稀釋液，密封，充分搖勻，一部分放于加入冰袋的保溫箱內用于分離培養，另一部分液凍存；

(二)病料處理

細菌裂解：病料用TE緩沖液懸浮后，加入抽提緩沖液，37℃哺育1h，再加入溶菌酶10mg/mL，37℃溫育2h；

細菌核酸抽提：采用常規酚/氯仿抽提，提取后對其進行瓊脂糖凝膠電泳驗證；

(三)套式PCR

設計并合成兩對套式PCR引物Pmuu492-1、Pmuu492-2和pm442-1、pm442-2。在Pmuu492-1與pm442-1的5’端加上GC?clmap結構。

套式PCR?16s?rDNA引物

取子宮黏液菌體稀釋的液1ml，利用菌體DNA提取試劑盒提取子宮粘液中的菌體總DNA；再以菌體總DNA為模板，利用Ex?Taq酶和引物Pmuu492-1、Pmuu492-2，進行第一次PCR擴增；PCR條件為94℃預變性8min；94℃變性25s、58℃退火45s、72℃延伸45s，30個循環后；72℃恒溫7min。再以擴增產物為模板，利用Ex?Taq酶和引物pm442-1、pm442-2進行第二次PCR擴增，PCR條件為94℃預變性10min；94℃變性45s、54℃退火60s、72℃延伸60s，35個循環；72℃恒溫10min；對于得到的擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，以驗證擴增產物；

(四)變性梯度凝膠電泳分析

采用Bio-Radoeode^TM?Universal?Mutation?Detection?System對套式PCR反應產物進行分離：

(1)變性梯度膠的制備：

使用梯度混合裝置，制備8％的聚丙烯酞胺凝膠，變性劑濃度從30％到60％(100％的變性劑為7mol/L的尿素和40％的去離子甲酰胺的混合物)，其中變性劑的濃度從膠的上方向下方依次遞增；

(2)套式PCR樣品的加樣：

待變性梯度膠完全凝固后，將膠板放入裝有電泳緩沖液的電泳槽中，取第二次PCR產物50微升加入上樣孔。

(3)電泳及染色：

在160v的電壓下，60℃電泳3h；電泳結束后，使用EB對凝膠進行染色0.5h；

(4)膠圖掃描：

將染色后的凝膠用Bio-Radoeode凝膠成像系統獲取膠圖；

(5)圖像分析

對各條帶進行標號，記錄；對各條帶內DNA比例關系并得到直觀的曲線圖并比較各條帶之間的DNA含量；根據以上分析得到優勢致病菌并確定回收目的帶；

(6)目條帶回收

對分析后選定的條帶，使用page膠回收試劑盒進行回收純化。

(7)連接反應