[發明專利]牛子宮內膜炎病原快速診斷方法

無效

• 申請號: 201010250097.3
• 申請日: 2010-08-11
• 公開（公告）號: CN101906478A
• 公開（公告）日: 2010-12-08
• 發明（設計）人: 張乃生;郭夢堯;王國卿;楊正濤;王海霞
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司 22100
• 代理人: 魏征驥

1.一種牛子宮內膜炎病原快速診斷方法，其特征在于包括下列步驟：

(一)病料的采集

利用子宮內膜活檢采樣器進行子宮樣品的采集，采集后將棉拭子放入含2ml滅菌生理鹽水2ml的凍存管內以制成菌體稀釋液，密封，充分搖勻，一部分放于加入冰袋的保溫箱內用于分離培養，另一部分液凍存；

(二)病料處理

細菌裂解：病料用TE緩沖液懸浮后，加入抽提緩沖液，37℃哺育1h，再加入溶菌酶10mg/mL，37℃溫育2h；

細菌核酸抽提：采用常規酚/氯仿抽提，提取后對其進行瓊脂糖凝膠電泳驗證；

(三)套式PCR

設計并合成兩對套式PCR引物Pmuu492-1、Pmuu492-2和pm442-1、pm442-2。在Pmuu492-1與pm442-1的5′端加上GC?clmap結構；

套式PCR?16s?rDNA引物，序列(5′→3′)

Pmuu492-1???ACTCCTACGGGAGGCAGCAG

Pmuu492-2???AACGCGAAGAACCTTAC

pm442-1?????CCTACGGGAGGCAGCAG

pm442-2?????CCGTCAATTCATTTGAGTTT

GCclmap?????CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG取子宮黏液菌體稀釋的液1ml，利用菌體DNA提取試劑盒提取子宮粘液中的菌體總DNA；再以菌體總DNA為模板，利用Ex?Taq酶和引物Pmuu492-1、Pmuu492-2，進行第一次PCR擴增；PCR條件為94℃預變性8min；94℃變性25s、58℃退火45s、72℃延伸45s，30個循環后；72℃恒溫7min；再以擴增產物為模板，利用Ex?Taq酶和引物pm442-1、pm442-2進行第二次PCR擴增，PCR條件為94℃預變性10min；94℃變性45s、54℃退火60s、72℃延伸60s，35個循環；72℃恒溫10min；對于得到的擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，以驗證擴增產物；

(四)變性梯度凝膠電泳分析

采用Bio-Radoeode^TM?Universal?Mutation?Detection?System對套式PCR反應產物進行分離：

(1)變性梯度膠的制備：

使用梯度混合裝置，制備8％的聚丙烯酞胺凝膠，變性劑濃度從30％到60％(100％的變性劑為7mol/L的尿素和40％的去離子甲酰胺的混合物)，其中變性劑的濃度從膠的上方向下方依次遞增；

(2)套式PCR樣品的加樣：

待變性梯度膠完全凝固后，將膠板放入裝有電泳緩沖液的電泳槽中，取第二次PCR產物50微升加入上樣孔。

(3)電泳及染色：

在160v的電壓下，60℃電泳3h；電泳結束后，使用EB對凝膠進行染色0.5h；

(4)膠圖掃描：

將染色后的凝膠用Bio-Radoeode凝膠成像系統獲取膠圖；

(5)圖像分析

對各條帶進行標號，記錄；對各條帶內DNA比例關系并得到直觀的曲線圖并比較各條帶之間的DNA含量；根據以上分析得到優勢致病菌并確定回收目的帶；

(6)目條帶回收

對分析后選定的條帶，使用page膠回收試劑盒進行回收純化。

(7)連接反應

(a).取一支0.5ml微離心管，置于冰浴中，分別加入：

10×連接Buffer???????????????1ul；

回收的PcR產物(1000ng/ul)?????5ul；

T載體(50ng/ul)???????????????1ul；

T4DNA連接酶??????????????????1ul；

DDW??????????????????????????70ul：

總體積???????????????????????15.0ul

(b).混勻，放在調好16℃的DNA連接儀內，然后置4℃冰箱冷藏放置10h；

(8)轉化

(a)轉化反應

在滅菌的1.5ml離心管中加入50ul?DH5α感受態菌及5ul的連接產物，混勻后冰浴30min；

將離心管移入52℃水浴中，2min后(切忌振蕩)。立即將離心管置于冰浴中5min；

向離心管中加入200ul?LB液體培養基，在：37℃恒溫振蕩器上以110r/min培養40min。以利于轉化后的受體菌，在良好的環境：通氣、新鮮的LB液體培養基中繁殖生長；

(b)涂板

取反應物在平板上涂布；涂布菌液的平板置室溫下干燥，然后倒置在37℃溫箱中培養12h。挑取單個陽性菌落，液體培養基擴人培養10h；

(9)質粒提取

(a).取1ml過夜培養的菌液加入1.5ml離心管中。于12000r/min×g離心30秒，去除上清；

(b).加250ul?Resuspension?Buffer，重懸細菌沉淀。再加入250ul細胞Lysis?Buffer，輕柔顛倒4-6次；

(c).加350ul?Neutralization?Buffer，立即輕柔顛倒離心管4-6次。于12000g離心10分鐘；

(d).將步驟3離心后得到上清轉移到Spin?column內，于6000r/min×g離心1分鐘，并棄去接液管中的液體；

(e).向Spin?cnlumn內加入650ul?Wash?Buffer，于12000g離心30-60秒，并棄去接液管中的液體。再重復一次此操作；

(f).再次于12000r/min×g離心1min，然后將Spin?column轉移到無菌的1.5ml離心管中，向Spin?column內加入50ul?Elution?Buffer，室溫靜置1min；

(10)測序：將質粒送去生物公司測序，然后與基因bank中收錄的相比對，確定治病菌種屬，完成診斷。