[發明專利]預防鴨病毒性肝炎的滅活疫苗及其制備方法

有效

• 申請號: 201010247306.9
• 申請日: 2010-08-06
• 公開（公告）號: CN101948809A
• 公開（公告）日: 2011-01-19
• 發明（設計）人: 劉文軍;周遠成;孫蕾;李晶
• 申請（專利權）人: 中國科學院微生物研究所
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12N7/02;A61K39/29;A61P31/14;A61P1/16;C12R1/93
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;任鳳華

1.鴨甲型肝炎病毒1型(Duck?hepatitis?A?virus?type?1)DHAV-SD株，其保藏號為CGMCC?No.3746。

2.鴨甲型肝炎病毒1型DHAV-SD株CGMCC?No.3746在制備1型鴨病毒性肝炎疫苗中的應用。

3.將鴨甲型肝炎病毒1型DHAV-SD株CGMCC?No.3746滅活得到的1型鴨病毒性肝炎疫苗。

4.制備DHAV-SD株病毒液的方法，包括如下步驟：將鴨甲型肝炎病毒1型DHAV-SD株CGMCC?No.3746在宿主細胞中進行培養后破碎細胞，收集上清液，該上清液即為DHAV-SD株病毒液；所述宿主細胞為BHK21細胞或DF-1細胞。

5.如權利要求4所述的方法，其特征在于：所述將鴨甲型肝炎病毒1型DHAV-SD株CGMCC?No.3746在宿主細胞中進行培養后破碎細胞，收集上清液的方法包括如下步驟：

①將鴨甲型肝炎病毒1型DHAV-SD株CGMCC?No.3746接種所述宿主細胞，進行培養后通過凍融破碎細胞，收取上清，即為生產用種毒；

②將生產用種毒接種所述宿主細胞，進行培養后通過凍融破碎細胞，收取上清，即為制苗用種毒；

③將制苗用種毒接種所述宿主細胞，進行培養后通過凍融破碎細胞，收集上清液。

6.如權利要求5所述的方法，其特征在于：所述步驟①、步驟②和步驟③中：接種所述宿主細胞時MOI均為0.001，培養時間均為48～72小時；所述步驟①、步驟②和步驟③中：培養時間優選為48小時；所述步驟③中，通過5000rpm離心30～40min收集上清液。

7.如權利要求4至6中任一所述的方法，其特征在于：所述宿主細胞為BHK21細胞；所述宿主細胞在所述接種前先進行如下擴增培養：

(1)將凍存的BHK21細胞37℃水浴融化，800rpm離心5min，取沉淀；用細胞培養液懸浮沉淀，得到2×10⁵細胞/ml的細胞懸液，37℃、5％CO₂靜置培養至每毫升含有1×10⁶細胞；

(2)在步驟(1)的基礎上消化細胞，然后重懸于細胞培養液中，使每毫升含有2×10⁵細胞，然后在如下條件下培養至每毫升含有1×10⁶細胞：pH7.4，溶解氧飽和度為50％、37℃，100轉/min。

8.一種制備1型鴨病毒性肝炎疫苗的方法，是將權利要求4至7中任一所述方法制備的DHAV-SD株病毒液作為制苗用病毒液依次進行滅活和乳化，得到1型鴨病毒性肝炎疫苗。

9.如權利要求8所述的方法，其特征在于：所述滅活的方法如下：在所述DHAV-SD株病毒液中加入甲醛，使甲醛的體積百分含量為0.1％，37℃滅活24小時，得到滅活后病毒液。

10.如權利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述乳化的方法如下：將3體積份油相、1體積份水相和1％(質量百分含量)硫柳汞水溶液混合，使硫柳汞的終濃度為0.01％(質量百分含量)，得到鴨病毒性肝炎疫苗；所述油相的制備方法如下：將94體積份白油和6體積份司本-80混合，得到混合液，每100毫升混合液中加入1.6～1.8克硬脂酸鋁；所述水相的制備方法如下：將4體積份吐溫-80和96體積份滅活后的病毒液混勻。