[發明專利]禾谷鐮孢菌對多菌靈的中等抗性水平菌株的分子檢測方法

有效

• 申請號: 201010247027.2
• 申請日: 2010-08-06
• 公開（公告）號: CN101985653A
• 公開（公告）日: 2011-03-16
• 發明（設計）人: 周明國;陳長軍;王建新;羅卿權
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
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• 代理人: 暫無信息

一、技術領域

本發明屬于一種禾谷鐮孢菌對多菌靈的中等抗藥性水平菌株的分子檢測方法，可用于監測苯并咪唑類殺菌劑(多菌靈)抗性禾谷鐮孢菌群體發展動態，進行抗藥性小麥赤霉病的流行預測。?

二、技術背景

小麥赤霉病是由禾谷鐮孢菌Fusarium?graminearum?Schwabe引起的一種世界性病害，嚴重影響小麥的產量和品質。長期以來采用苯并咪唑類殺菌劑或以這類藥劑為主的復配劑進行化學防治。苯并咪唑類殺菌劑包括多菌靈、苯菌靈、噻菌靈、硫菌靈等。作為一類高效、廣譜內吸性殺菌劑在生產上應用，解決了保護性殺菌劑的環境毒性問題，提高了人類控制該病害的能力。苯并咪唑類殺菌劑具有相同的抗菌譜和抗菌機制，他們也具有相同的抗藥性機制，相互之間存在正交互抗藥性。由于這類藥劑的高度專化性，作用位點單一，加上施用頻率高，多年使用后許多植物病原真菌群體中出現了抗藥性優勢生理小種，使藥劑防治效果下降或完全失去效果。經過10多年的研究，南京農業大學殺菌劑實驗室發現小麥赤霉病菌對多菌靈的抗藥性菌株主要是由于禾谷鐮孢菌β₂-微管蛋白基因(FGSG_06611.3)突變造成，該基因編碼第167位和第200位氨基酸密碼子的突變分別為TTT(Phe)→TAT(Tyr)和TTC(Phe)→TAC(Tyr)。第167位或者第200位氨基酸密碼子的突變均可引起禾谷鐮孢菌對多菌靈中等抗藥性的產生，其中第167位突變占所有抗藥性突變類型總量的97％以上。成為病原菌產生田間抗藥性的主要原因。?

由于病原菌在自然界的數量巨大，抗藥性個體在群體中的比例達到3％～5％時，即可引起抗藥性病害流行，使藥劑防治失敗。傳統的檢測方法需要分離培養病原菌，然后在含藥培養基上培養，再根據藥劑對菌絲生長的效應鑒別抗藥性。本發明在抗藥性機制研究基礎上，根據基因點突變類型應用PIRA-PCR技術檢測病原真菌對多菌靈等苯并咪唑類殺菌劑的抗藥性，則能快速、準確檢測樣本。PIRA-PCR技術較等位基因特異性PCR(ASO-PCR)更為準確，不會有假陽性結果。它具有(1)快速、準確檢測出禾谷鐮孢菌群體中的中等抗性菌株；(2)準確鑒定菌株的抗藥性基因型；(3)耗時短，僅需5～8小時。?

三、發明內容

技術問題?本發明的目的在于提供禾谷鐮孢菌對多菌靈產生中抗水平菌株一種快速診斷和檢測方法?，F有技術首次利用PIRA-PCR，根據抗性菌株發生突變的特點，結合了巢式PCR技術成功實現了快速、準確地對小麥赤霉病菌抗多菌靈中抗群體的分子檢測，檢測準確率達到95％以上，對及時采取有效措施控制當季抗藥性病害流行，具有實用價值。?

技術方案?禾谷鐮孢菌抗多菌靈的中抗菌株β₂-微管蛋白基因(FGSG_06611.3)，其第167位氨基酸密碼子發生點突變TTT(Phe)→TAT(Tyr)或第200位氨基酸密碼子發生點突變TTC(Phe)→TAC(Tyr)。?

一種禾谷鐮孢菌對多菌靈產生中抗水平菌株檢測方法，共分三步：?

第一步：采用常規的苯酚·氯仿·異戊醇法，分別提取待測樣品的核基因組DNA。?

第二步：運用內外引物對，進行巢式PCR反應，獲得164bp的目標片段。?

用于PIRA-PCR技術引物具有特異性，該引物對能為β₂-微管蛋白167位未突變菌株人為引入HindIII酶切識別位點；巢式PCR技術的設計用于提高反應效率。設計的依據是抗藥性菌株在β₂-微管蛋白第167位由Phe(TTT)→Tyr(TAT)，200位由Phe(TTC)→Tyr(TAC)。?

①擴增禾谷鐮孢菌β₂-微管蛋白基因片斷的外引物對?

上游引物NoF?5′-AAGCCATTGATGTTGTTCG-3′?

下游引物NoR?5′-CATGACGGTAGAAATCAGGTAG-3′?

②擴增含人為引入錯配堿基β₂-微管蛋白基因片段的內引物對?

上游引物Hind3F?5′-CGATCGCATAATGGC?A?CT-3′?

下游引物Hind3R?5′-GGGTCCTCTCGTAGATATCGTACA-3′?

巢式PCR反應體系及其擴增程序：?

(1)外引物擴增：?

反應體系：?

PCR?buffer(10×)????????2.5μL?

dNTP(2.5mM?each)????????2μL?