[發(fā)明專利]禾谷鐮孢菌對多菌靈的中等抗性水平菌株的分子檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010247027.2
• 申請日: 2010-08-06
• 公開（公告）號: CN101985653A
• 公開（公告）日: 2011-03-16
• 發(fā)明（設計）人: 周明國;陳長軍;王建新;羅卿權
• 申請（專利權）人: 南京農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.禾谷鐮孢菌(Fusarium?graminearum)對多菌靈的中等抗性水平菌株的分子檢測方法，其特征在于采用PIRA-PCR(Primer-introduced?restriction?analysis?PCR)技術檢測禾谷鐮孢菌群體中存在的對苯并咪唑類殺菌劑(多菌靈)的中等抗性菌株，并以此計算抗性比例。

一種禾谷鐮孢菌對多菌靈產(chǎn)生中等抗性水平菌株的分子檢測方法，共分三步：

第一步：采用常規(guī)的苯酚·氯仿·異戊醇法，分別提取待測樣品的核基因組DNA。

第二步：運用內(nèi)外引物對，進行巢式PCR反應，獲得164bp的目標片段。

巢式PCR反應體系及其擴增程序：

(1)外引物擴增：

反應體系：

PCR?buffer(10×)?????2.5μL

dNTP(2.5mM?each)?????2μL

MgCl₂(25mM)??????????1.5μL

NoF(10μM)???????????0.5μL

NoR(10μM)???????????0.5μL

dH₂O(滅菌蒸餾水)?????16.8μL

Taq(5U/μL)??????????0.2μL

DNA模板??????????????1.0μL

????????????????????????

總體積???????????????25μL

擴增條件：

預變性：94℃?????????5min

????????????↓

變性：94℃???????????15s

退火：58℃???????????30s

延伸：72℃???????????30s

35個循環(huán)

????????????↓

延伸：72℃???????????5min

(2)內(nèi)引物擴增：

反應體系：

PCR?buffer(10×)?????2.5μL

dNTP(2.5mM?each)??????????2μL

MgCl₂(25mM)???????????????1.5μL

NoF(10μM)????????????????0.5μL

NoR(10μM)????????????????0.5μL

dH₂O(滅菌蒸餾水)??????????16.8μL

Taq(5U/μL)???????????????0.2μL

DNA模板*??????????????????1.0μL

???????????????????????????????????

總體積????????????????????25μL

*DNA模版為外引物擴增產(chǎn)物稀釋50～100倍量濃度

擴增條件：

預變性：94℃??????????????5min

??????????????↓

變性：94℃????????????????15s

退火：56℃????????????????30s

延伸：72℃????????????????30s

35個循環(huán)

??????????????↓

延伸：72℃????????????????5min

第三步：將巢式PCR獲得的目的條帶(164bp)限制性內(nèi)切酶HindIII和TaaI(Tsp4CI)分別酶切，從酶切產(chǎn)物電泳圖譜(3％瓊脂糖凝膠)可以準確鑒定中等抗性菌株基因型，并以此判斷菌株抗性水平。

(1)HindIII酶切體系：

10×Buffer?R??????????????2μL

HindIII(10unit/μL)???????1μL

PCR產(chǎn)物???????????????????8μL

dH₂O(滅菌蒸餾水)??????????9μL

?????????????????????????????????

總體積????????????????????20μL

37℃孵育1～3小時完全酶切

(2)TaaI酶切體系：

10×Buffer?Tango??????????2μL

TaaI(10unit/μL)??????????1μL

PCR產(chǎn)物???????????????????8μL

dH₂O(滅菌蒸餾水)??????????9μL

?????????????????????????????

總體積????????????????????20μL

65℃孵育1～3小時完全酶切。

2.根據(jù)權利要求1，禾谷鐮孢菌對多菌靈產(chǎn)生中抗水平菌株的檢測技術其特征在于：用于PIRA-PCR反應的引物引入了HindIII酶切識別位點特異性地識別抗藥性菌株在β₂-微管蛋白基因編碼第167位氨基酸的密碼子由TTT(Phe)→TAT(Tyr)，和第200位密碼子由TTC(Phe)→TAC(Tyr)的突變；巢式PCR技術的設計用于提高反應效率。

①擴增禾谷鐮孢菌β₂-微管蛋白基因片斷的外引物對

上游引物NoF?5′-AAGCCATTGATGTTGTTCG-3′

下游引物NoR??5′-CATGACGGTAGAAATCAGGTAG-3′

②擴增含人為引入錯配堿基β₂-微管蛋白基因片段的內(nèi)引物對

上游引物Hind3F?5′-CGATCGCATAATGGCACT-3′

下游引物Hind3R?5′-GGGTCCTCTCGTAGATATCG-3′