[發(fā)明專利]富集肺癌細(xì)胞復(fù)合納米微球的制備

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010246315.6
• 申請日: 2010-08-06
• 公開（公告）號: CN102344117A
• 公開（公告）日: 2012-02-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳崗;嚴(yán)彪;李成魁;李輝
• 申請（專利權(quán)）人: 同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院
• 主分類號: B82B1/00
• 分類號: B82B1/00;B82B3/00;H01F1/36;G01N1/34;G01N33/50
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 薛琦;朱水平

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于高分子化學(xué)和細(xì)胞生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種結(jié)合肺癌細(xì)胞的復(fù)合Fe₃O₄磁性納米顆粒及其制備方法，以及一種富集和檢測痰液中肺癌細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)

肺癌居十大惡性腫瘤之首，具有“三高”現(xiàn)象：發(fā)病率高、死亡率高、上升幅度高；是影響人類健康的主要疾病，與愛滋病并列成為21世紀(jì)主要醫(yī)學(xué)問題之一。憑借目前診斷肺癌的手段，一旦發(fā)現(xiàn)和確診是肺癌，基本上處于中晚期，尚難以獲得有效的控制。因此，實現(xiàn)肺癌的早期診斷是實現(xiàn)早期治療的長期未能破解的國際醫(yī)學(xué)難題。

痰液細(xì)胞病理學(xué)檢查是目前極有希望開發(fā)推廣為早期診斷肺癌的最有效的方法。目前存在的最主要問題是：1、痰液送檢費時費力；2、假陰性率高(20～40％)，原因在于：痰液制片手工操作而導(dǎo)致細(xì)胞丟失(標(biāo)本不能全部取用)、涂片的質(zhì)量太差(不均勻、過厚，過多的黏液、血液或炎細(xì)胞遮蓋了不正常的細(xì)胞、細(xì)胞形態(tài)保存不佳)，細(xì)胞成分復(fù)雜(大量脫落上皮細(xì)胞、炎癥細(xì)胞)，脫落肺癌細(xì)胞散在，分布不均。

所以，必須去除無關(guān)細(xì)胞，才能做到低成本地連續(xù)檢測，大幅度提高陽性率。因此，肺癌細(xì)胞分離富集是實現(xiàn)肺癌早期診斷這個國際性難題首先要解決的問題。如果能夠?qū)ふ业揭环N比較簡便實用的方法將肺癌細(xì)胞從痰液中分離出來富集，早期治療肺癌就有希望。

發(fā)明內(nèi)容

因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題就是針對痰液中細(xì)胞成分復(fù)雜，檢測痰液中肺癌脫落細(xì)胞假陰性率高的缺陷，提供一種結(jié)合肺癌細(xì)胞的復(fù)合Fe₃O₄磁性納米顆粒及其制備方法，和一種檢測痰液中肺癌細(xì)胞的方法。該方法檢測痰液中肺癌細(xì)胞具有較高的陽性率。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之一是：一種結(jié)合肺癌細(xì)胞的復(fù)合Fe₃O₄磁性納米顆粒，其是在表面修飾著聚乙酰亞胺，并標(biāo)記有對肺癌細(xì)胞具有結(jié)合能力的復(fù)合蛋白的Fe₃O₄磁性納米顆粒，其中，所述的對肺癌細(xì)胞具有結(jié)合能力的復(fù)合蛋白是由蛋白SPA(葡萄球菌A蛋白)和選自抗CD44抗體和抗CK7抗體中的一種或兩種組成的復(fù)合蛋白。所述的抗CD44抗體優(yōu)選兔抗人CD44，抗CK7抗體優(yōu)選兔抗人CK7。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之二是：一種如上所述的結(jié)合肺癌細(xì)胞的復(fù)合Fe₃O₄磁性納米顆粒的制備方法，包括以下步驟：

1)制備Fe₃O₄磁性納米顆粒；

2)在步驟1)所得的Fe₃O₄磁性納米顆粒表面修飾聚乙酰亞胺；

3)在步驟2)所得的聚乙酰亞胺修飾的Fe₃O₄磁性納米顆粒表面標(biāo)記對肺癌細(xì)胞具有結(jié)合能力的復(fù)合蛋白，該復(fù)合蛋白是由蛋白SPA和選自抗CD44抗體和抗CK7抗體中的一種或兩種組成的復(fù)合蛋白。

本發(fā)明中，步驟1)制備Fe₃O₄磁性納米顆粒的方法可以本領(lǐng)域常規(guī)方法，較佳的采用共沉淀法。更佳的步驟1)具體包括：將硝酸鐵和硝酸亞鐵以摩爾質(zhì)量比為4∶1的比例于乙醇中形成分散均勻的乙醇溶液，其中鐵離子濃度為0.5～1.0mol/L；在制得的乙醇溶液中加入摩爾質(zhì)量10倍于鐵離子的環(huán)氧氯丙烷形成溶膠，靜置后形成凝膠；制得的凝膠經(jīng)陳化后用去離子水清洗并干燥；清洗并干燥后的凝膠進(jìn)行400℃下退火處理即制得Fe₃O₄沉淀；將制得的Fe₃O₄沉淀依次用去離子水和乙醇交替清洗，至pH值為中性，真空干燥，即得Fe₃O₄磁性納米顆粒。步驟1)所述的Fe₃O₄磁性納米顆粒的平均粒徑范圍較佳的是15～50nm，更佳的是20nm。