[發明專利]富集肺癌細胞復合納米微球的制備

有效

• 申請號: 201010246315.6
• 申請日: 2010-08-06
• 公開（公告）號: CN102344117A
• 公開（公告）日: 2012-02-08
• 發明（設計）人: 陳崗;嚴彪;李成魁;李輝
• 申請（專利權）人: 同濟大學附屬上海市肺科醫院
• 主分類號: B82B1/00
• 分類號: B82B1/00;B82B3/00;H01F1/36;G01N1/34;G01N33/50
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 薛琦;朱水平

1.一種結合肺癌細胞的復合Fe₃O₄磁性納米顆粒，其特征在于，其是在表面修飾著聚乙酰亞胺，并標記有對肺癌細胞具有結合能力的復合蛋白的Fe₃O₄磁性納米顆粒，其中，所述的對肺癌細胞具有結合能力的復合蛋白是由蛋白SPA和選自抗CD44抗體和抗CK7抗體中的一種或兩種組成的復合蛋白。

2.一種如權利要求1所述的結合肺癌細胞的復合Fe₃O₄磁性納米顆粒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)制備Fe₃O₄磁性納米顆粒；

2)在步驟1)所得的Fe₃O₄磁性納米顆粒表面修飾聚乙酰亞胺；

3)在步驟2)所得的聚乙酰亞胺修飾的Fe₃O₄磁性納米顆粒表面標記對肺癌細胞具有結合能力的復合蛋白，該復合蛋白是由蛋白SPA和選自抗CD44抗體和抗CK7抗體中的一種或兩種組成的復合蛋白。

3.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟1)所述的Fe₃O₄磁性納米顆粒的平均粒徑范圍是15～50nm。

4.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟1)包括：將硝酸鐵和硝酸亞鐵以摩爾質量比為4∶1的比例于乙醇中形成分散均勻的乙醇溶液，其中鐵離子濃度為0.5～1.0mol/L；在制得的乙醇溶液中加入摩爾質量10倍于鐵離子的環氧氯丙烷形成溶膠，靜置后形成凝膠；制得的凝膠經陳化后用去離子水清洗并干燥；清洗并干燥后的凝膠進行400℃下退火處理即制得Fe₃O₄沉淀；將制得的Fe₃O₄沉淀依次用去離子水和乙醇交替清洗，至pH值為中性，真空干燥，即得Fe₃O₄磁性納米顆粒；

步驟2)包括：

將Fe₃O₄磁性納米顆粒置于PBS緩沖溶液中，超聲分散，緩慢加入聚乙酰亞胺(PEI)，慢速充分攪拌均勻后，移至恒溫水浴上繼續慢速攪拌24小時，水浴溫度保持30℃；

用磁分離法將固體從溶液中分離，將固體依次用蒸餾水和甲醇交替清洗至pH值為中性，真空干燥，即得PEI修飾的Fe₃O₄納米粒子；

步驟3)包括：

將聚乙酰亞胺修飾的Fe₃O₄納米粒子懸浮于0.01M?pH7.2TBS之中，得納米粒子溶液，其中聚乙酰亞胺修飾的Fe₃O₄納米粒子的濃度約為3×10¹³個/ml；

用0.01M?pH7.2TBS分別溶解蛋白A和蛋白B，混勻，4℃反應30分鐘，即得復合蛋白溶液，其中，蛋白A濃度為10mg/ml，蛋白B濃度為1mg/ml，蛋白A是蛋白SPA，蛋白B是抗CD44抗體和/或抗CK7抗體；

將上述復合蛋白溶液與上述納米粒子溶液均勻混合，室溫60分鐘，即得復合納米磁性顆粒溶液。

5.一種富集痰液中肺癌細胞的方法，其特征在于，包括以下步驟：

a)采集痰液，充分液化痰液；

b)在步驟a)所得的液化痰液中加入如權利要求1所述的復合納米磁性顆粒的溶液進行反應；

c)將步驟b)的反應液離心富集其中的細胞。

6.一種檢測痰液中肺癌細胞的方法，其特征在于，包括以下步驟：

a)采集痰液，充分液化痰液；

b)在步驟a)所得的液化痰液中加入如權利要求1所述的復合納米磁性顆粒的溶液進行反應；

c)將步驟b)的反應液離心富集其中的細胞，將所得細胞重新懸浮，然后采用液基薄層細胞學檢測系統將該懸浮液制片、染色、封片、鏡檢。

7.如權利要求5或6所述的方法，其特征在于，步驟a)所述的痰液中加入堿性裂解液以充分液化痰液，所述的堿性裂解液：1％蛋白酶K，10％NaOH的水溶液。

8.如權利要求5或6所述的方法，其特征在于，步驟b)所述的反應是室溫靜置15分鐘。

9.如權利要求5或6所述的方法，其特征在于，步驟c)所述的離心是500rpm，5分鐘；離心所得的細胞懸浮在保存液中，保存液是：10％甲醇水溶液。