[發明專利]一種無需提取動物組織DNA的直接PCR方法

無效

• 申請號: 201010245529.1
• 申請日: 2010-08-04
• 公開（公告）號: CN102344919A
• 公開（公告）日: 2012-02-08
• 發明（設計）人: 吳常信;李紅偉;徐海岳;趙春江
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王加嶺;張慶敏

技術領域

本發明涉及動物分子生物學領域，具體涉及利用特定的組織裂解液對動物組織包括耳組織、血液或毛發進行快速消化，然后直接用少量的該消化液作為模板，實現PCR擴增。

背景技術

基因組DNA的制備對完成PCR擴增是必不可少的，在動物遺傳育種中，PCR擴增是進行基因多態性分析、微衛星分析、基因克隆和測序等研究工作的基礎。目前，經常用于DNA提取的動物組織包括耳組織、血液及毛。通常，動物組織樣品DNA的提取采用的是傳統的酚-氯仿抽提法，但該方法存在步驟繁瑣、耗時、耗試劑及安全性差等缺點。如果用該方法大量提取動物組織樣品時，上述的缺點將更加突出。一些在此基礎改進的方法已有報道，同時也有很多商業化的DNA提取試劑盒，但這些改進的方法及商業試劑盒存在一個共性：提取過程仍需要組織樣品的裂解、DNA的乙醇或異丙醇沉淀和70％乙醇清洗DNA這三步，因此在提取大量動物組織樣品的DNA時，也同樣表現出耗時及費用高的缺點。此外，有報道用整個果蠅的胚胎、幼蟲及成蟲直接作為模板進行PCR擴增。但用整個動物組織如耳組織、毛囊直接作為模板進行PCR擴增是行不通的。

發明內容

本發明的目的是提供一種無需提取動物組織DNA的直接PCR方法，此方法可以同時處理大量動物組織樣品，實現高通量的以PCR擴增為基礎的分子操作，快速簡化操作步驟，節省成本。

本發明提供一種無需提取動物組織DNA的直接PCR方法，其中PCR擴增所用的模板為動物組織經組織裂解液消化后的消化液。

所述PCR反應按如下步驟進行：

將動物組織與組織裂解液混合，37～55℃溫育25～30min，優選為55℃溫育30min，95℃變性5min，取2μl作模板；

PCR反應體系：終濃度為250μM的dNTP，10mMTris-Cl，pH8.3，50mM?KCl，1.5mM?MgCl₂，2pM上游引物，2pM下游引物，2μl組織消化液，1U?Taq?DNA聚合酶，用ddH₂O補足至20μl；

PCR反應條件：94℃預變性4min，94℃變性30s，61℃復性30s，72℃延伸20～40s，40個循環，然后72℃延伸7min，最后16℃保溫。

所述的動物組織選自耳組織、血液或毛發，所述的毛發帶有毛囊。

所述組織裂解液由Tris-Cl、EDTA、蛋白酶K和NaCl組成。

所述Tris-Cl的濃度為10mM～100mM，優選10mM，pH8.0；所述的EDTA濃度為1～4mM，優選為2mM，pH8.0，所述的蛋白酶K的濃度為100ug/ml～200ug/ml，優選為200μg/ml；所述的NaCl的濃度為0～0.8M，優選為0.2M。

本發明提供的無需提取動物組織DNA的直接PCR方法，和目前存在的方法和試劑盒相比，該方法簡單、快速和節約成本。使用該方法，僅需一步處理動物組織樣品，然后直接取2μl處理液為模板完成PCR擴增。此外，該方法特別適用于小組織樣品如一根動物毛，因為用目前存在的方法和試劑盒，至少需要5～6根動物毛才能完成DNA的提取。該方法從樣品處理到PCR擴增都在PCR儀上完成，在動物中可以實現高通量的以PCR擴增為基礎的分子操作如基因分型、微衛星分析、親子鑒定及基因的克隆和測序。

附圖說明

圖1所示為不同裂解液處理豬耳組織后直接PCR法擴增的產物。圖中，1、2、3、4分別表示用裂解液1、裂解液2、裂解液3、裂解液4處理豬耳組織后直接PCR法擴增的產物。5表示沒有經任何裂解液處理，直接用耳組織作模板PCR擴增的產物。

圖2所示為裂解液中不同EDTA濃度對PCR擴增效率的影響。

圖3所示為裂解液中不同EDTA濃度的PCR電泳圖。

圖4所示為裂解液中不同NaCl濃度對PCR擴增效率的影響。

圖5所示為馬毛、雞血、及豬耳組織經優化的組織裂解液處理后直接PCR擴增結果。圖中1、3和5表示馬毛、雞血及豬耳組織經優化組織裂解液處理后直接PCR擴增的結果；2、4和6表示用傳統酚-氯仿抽提法從馬毛、雞血及豬耳組織提取的DNA為模板PCR擴增的結果。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。

若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。

實施例1