[發明專利]軟骨細胞仿生培養模型及其制備方法

有效

• 申請號: 201010245254.1
• 申請日: 2010-08-04
• 公開（公告）號: CN102344905A
• 公開（公告）日: 2012-02-08
• 發明（設計）人: 葛子鋼
• 申請（專利權）人: 北京大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/077
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 張慶敏;王加嶺

技術領域

本發明涉及軟骨細胞仿生培養領域，特別是，涉及一種軟骨細胞仿生培養模型。

背景技術

對于關節軟骨損傷，目前臨床手術干預主要包括骨髓刺激方法(鉆孔和微骨折)，自體軟骨細胞移植，自體骨軟骨移植，骨膜或軟骨膜移植，以及多種形式生物材料的輔助應用。盡管上述方法都取得了一定程度的成功，但無論單獨使用還是組合使用都不足以完全恢復具有多層解剖結構的骨軟骨解剖功能，主要表現為新生軟骨的力學性能不足，生化組成不良，與周圍組織結合不良，直接導致了中遠期臨床治療效果下降(see?Hunziker?EB.Osteoarthritis?Cartilage2002；10(6)：432-63；Wang?DA，et?al.Nat?Mater?2007；6(5)：385-92)。

目前軟骨損傷的基礎研究主要包括體外實驗和動物實驗兩部分。體外研究方法包括平面培養，小球培養(pellet?culture)和三維支架材料培養。其中平面培養能夠大量增殖軟骨細胞(可達1,000倍)，但同時軟骨細胞會發生嚴重的退分化現象(dedifferentiation)(seeGoldring?MB.Methods?Mol?Med?2004；100：37-52)。雖然退分化的軟骨細胞有可能在軟骨環境中再次分化成軟骨細胞，但這還取決于退分化程度和體內局部微環境等諸多因素，增加了實驗結果的不穩定性(seeHwang?NS，et?al.Tissue?Eng?2006；12(9)：2695-706)。

小球培養(pellet?culture)模仿了軟骨形成早期的高細胞密度，低氧以及細胞與細胞之間緊密聯結的環境(see?Toh?WS，et?al.StemCells?2007；25(4)：950-60)，是最為廣泛使用的體外模型。除了欠缺標準化操作外，兩個主要缺陷限制了上述兩種模型的廣泛使用：

1)不能評價新生軟骨與宿主軟骨的結合；

2)不能評價周圍軟骨組織對新植入的軟骨細胞和再生的軟骨的調控作用。

三維支架材料輔助軟骨再生取得了很大進步，但支架的結構和材料的物理化學性能多樣性阻礙了它作為標準模型的使用(see?Cao?T，etal.Cloning?Stem?Cells?2008；10(1)：1-10)。

發明內容

本發明的目的是提供一個新的體外軟骨細胞培養模型，不僅模仿微環境所面臨的體內軟骨再生環境，還可以評價軟骨和骨的形成，以解決現有技術存在的缺陷。

本發明提供一種軟骨細胞仿生培養模型，其通過下述方法制備而成：

1)制取中心帶有鉆孔的表層軟骨骨塊模型，用PBS清洗，用γ射線消毒；

2)將1.1-1.3％(g/dl，下同)海藻酸鈉加至細胞培養板，然后將步驟1得到的骨塊模型放入細胞培養板各孔；

3)向孔中和骨塊模型周圍加入0.1-0.15MCaCl₂溶液，使其凝固；

4)吸出步驟3加入的CaCl₂溶液，用細胞培養液潤洗。

其中，所述步驟1中，表層軟骨取自于比較大型的動物，如牛、豬馬或羊等。

所述步驟2中，將1.2％海藻酸鈉加至細胞培養板。

所述步驟3中，向孔中和骨塊模型周圍加入0.1MCaCl₂溶液。

所述步驟3中，凝固后，在4℃冰箱放置2h。

步驟4中，所述的細胞培養液通過下述步驟制成：向滅菌后的培養瓶中加入180mL?DMEM原液，20mL融化的FBS，再加入1000X的PS?200μL，整個過程保持無菌環境。

所述PS是雙抗，其組成為Penicillin和Streptomycin

本發明還提供制備上述軟骨細胞仿生培養模型的方法，包括下述步驟：

1)制取中心帶有鉆孔的表層軟骨骨塊模型，用PBS清洗，用γ射線消毒；

2)將1.1％-1.3％海藻酸鈉加至細胞培養板，然后將步驟1得到的骨塊模型放入細胞培養板各孔；

3)向孔中和骨塊模型周圍加入0.1-0.15MCaCl₂溶液，使其凝固；

4)吸出步驟3加入的CaCl₂溶液，用細胞培養液潤洗。

其中，步驟1中，鉆透骨塊的目的在于：利用海藻酸鈉溶液與氯化鈣的凝固作用使骨塊固定，海藻酸鈉凝膠為透明狀，封底可以利用顯微鏡觀察細胞在模型中的生長狀況。

步驟2中，加海藻酸鈉溶液至細胞培養板中，海藻酸鈉溶液不沒過模型，主要是為了固定骨塊模型。