[發明專利]一種豬瘟病毒核酸標準物質的制備方法

無效

• 申請號: 201010245134.1
• 申請日: 2010-08-05
• 公開（公告）號: CN101906487A
• 公開（公告）日: 2010-12-08
• 發明（設計）人: 戴志紅;關孚時;王在時;蔣卉;李翠
• 申請（專利權）人: 中國獸醫藥品監察所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 北京君智知識產權代理事務所 11305
• 代理人: 鄭明

技術領域

本發明涉及豬瘟病毒核酸標準物質的制備方法，屬于標準物質技術和獸用生物制品技術領域。

背景技術

豬瘟(Classical?Swine?Fever，CSF)是由豬瘟病毒(Classical?Swine?Fever?Virus，CSFV)引起的一種高度接觸性、致死性的豬傳染病，在世界上很多國家和地區均有發生，給畜牧業生產帶來了嚴重的經濟損失。世界動物衛生組織(OIE)將豬瘟列為法定通報性疫病，我國將其劃為一類動物傳染病。

隨著分子生物學檢測技術發展，RT-PCR、熒光定量PCR等檢測技術也逐漸廣泛應用于豬瘟病毒檢測。這類技術通過檢測病毒特異性的核酸片段來檢測豬瘟病毒，具有靈敏性高、檢測快速等優點；但也易受試劑盒質量、核酸提取、翻轉錄效率、核酸污染、RNA酶污染等影響，實驗結果往往因為試劑質量、人員的經驗和能力以及實驗設施、環境的影響而存在較大誤差，嚴重制約了檢測結果的準確性，因此亟需使用標準物質作為客觀、公正的標尺，用于檢測試劑盒產品的質量控制、科學研究與實驗室診斷的參照以及實驗室之間的能力比對。然而，由于豬瘟病毒核酸標準物質的質量要求很高，制備程序和檢驗、標定方法嚴格，有關制備程序和標定方法至今未見報道。

發明內容

本發明的目的是建立一種豬瘟病毒核酸標準物質的制備方法。

本發明包括以下技術方案：

(1)選擇豬瘟病毒基因保守區為擴增靶區，與一般PCR或熒光PCR檢測的目標片段相適應；

(2)設計、合成針對該基因保守區的上下游引物；

(3)目標序列擴增：用RNA提取試劑盒提取病毒液(組織)總RNA；用隨機引物反轉錄，獲得總cDNA；再用病毒特異的上下游引物擴增目標片段；通過核酸電泳檢測擴增產物；

(4)目的基因的克?。簩U增產物用純化試劑盒純化、回收；將目的基因片段克隆至載體；轉化感受態大腸桿菌；涂于篩選培養基，37℃培養12-16h；挑取轉化成功的菌落，接種于液體培養基，37℃振蕩培養12～16h；用質粒提取試劑盒提取重組質粒，雙向測序鑒定；

(5)體外轉錄：對提取的質粒酶切；回收含啟動子和目的基因的DNA片段；用轉錄試劑盒進行體外轉錄；加入DNase去除轉錄產物中的DNA；重新提取、純化RNA；在無RNA酶的水中重溶RNA；

(6)分裝：將重溶的RNA分裝至無RNA酶的小管中，20μL/管，-80℃凍存；

(7)RNA拷貝數測定：取體外轉錄的RNA(6)，用無RNA酶滅菌水作10倍和100倍稀釋，測定其在260nm和280nm的吸光度值(OD)，根據吸光值及稀釋倍數計算體外轉錄樣品濃度，必要時可測定多次統計分析；根據已知RNA核酸序列，推算單個RNA模板的分子量；根據樣品濃度和單個RNA分子量計算RNA單位體積內的拷貝數；

(8)檢驗：

1)均勻性試驗：從樣品隨機選取一定數量的樣品(根據統計需要)，檢測每個樣品單位體積RNA拷貝數，對結果進行統計分析，要求各樣品的檢測值之間經統計分析無顯著差異；

2)穩定性試驗：每隔一定時間隨機抽取樣品進行檢測，根據單位體積RNA拷貝數下降情況，計算其保存期；

(9)協作標定：將樣品分發國內相關機構，讓各單位檢測收到的樣品單位體積RNA拷貝數；

(10)定值：對所有樣品的測定結果進行統計、分析，剔除異常值；確定該標準物質最終的單位體積RNA拷貝數。

本發明的詳細描述

1.選擇豬瘟病毒基因保守區5’端非編碼區(5’UTR)為擴增靶區。

2.設計、合成引物：

A1：5’-AGT?ACA?GGG?TAG?TCG?TCA?GTG?GTT?CG-3’；

A2：5’-CTG?CTG?TAC?ATG?GCA?CAT?GGA?GTT?G-3’；

由上海英駿生物技術有限公司合成，用DEPC水配成0.25μM，-20℃保存備用。

3.目標序列擴增：

用TRIzol?Reagent試劑盒(購自Invitrogen公司)提取病毒液(組織)總RNA；取10μl?RNA，加入2μl?Oligo(dT)和8μl反轉錄液(5×Buffer?4μl，2μl?DTT，1μl?dNTP，0.5μl反轉錄酶，0.5μl?RNasin)，按42℃60min、70℃/15min反轉錄，獲得總cDNA；