[發明專利]一種豬瘟病毒核酸標準物質的制備方法

無效

• 申請號: 201010245134.1
• 申請日: 2010-08-05
• 公開（公告）號: CN101906487A
• 公開（公告）日: 2010-12-08
• 發明（設計）人: 戴志紅;關孚時;王在時;蔣卉;李翠
• 申請（專利權）人: 中國獸醫藥品監察所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 北京君智知識產權代理事務所 11305
• 代理人: 鄭明

1.一種豬瘟病毒核酸標準物質的制備方法，其特征在于包括以下技術步驟：

(1)選擇豬瘟病毒基因保守區為擴增靶區；

(2)設計、合成針對該基因保守區的上下游引物；

(3)目標序列擴增：提取病毒液或組織的總RNA；用隨機引物反轉錄，獲得cDNA；再用上下游引物擴增目標片段；電泳檢測擴增產物；

(4)目的基因的克隆：將擴增產物純化、回收；將目的基因片段克隆至載體；轉化感受態細胞；挑取轉化成功的菌落，大量培養；提取重組質粒，雙向測序鑒定；

(5)體外轉錄：對提取的質粒酶切；回收含啟動子和目的基因的DNA片段；用轉錄試劑盒進行體外轉錄；加入DNase去除轉錄產物中的DNA；重新提取、純化RNA；在無RNA酶的水中重溶RNA；

(6)分裝：將重溶的RNA分裝至無RNA酶的小管中，20μL/管，-80℃凍存；

(7)RNA拷貝數測定：取體外轉錄的RNA，用無RNA酶滅菌水作10倍和100倍稀釋，測定其在260nm和280nm的OD值，計算體外轉錄樣品濃度；根據已知RNA核酸序列，推算單個RNA模板的分子量，計算RNA單位體積內的拷貝數；

(8)檢驗：

1)均勻性試驗：從樣品隨機選取一定數量的樣品，檢測每個樣品單位體積RNA拷貝數，對結果進行統計分析，要求各檢測值之間無顯著差異；

2)穩定性試驗：每隔一定時間隨機抽取樣品進行檢測，根據單位體積RNA拷貝數下降情況，計算其保存期；

(9)協作標定：將樣品分發國內相關機構，檢測單位體積RNA拷貝數；

(10)定值：對所有測定結果進行統計、分析，剔除異常值；確定該標準物質最終的單位體積RNA拷貝數。