[發明專利]雜交瘤細胞株1C11、其產生的抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體及其應用

有效

• 申請號: 201010245095.5
• 申請日: 2010-08-05
• 公開（公告）號: CN101993855A
• 公開（公告）日: 2011-03-30
• 發明（設計）人: 李培武;李鑫;張道宏;張奇;張文;丁小霞;姜俊;陳小媚
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院油料作物研究所
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/14;G01N33/577;C12R1/91
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司 42102
• 代理人: 胡建平

技術領域

本發明涉及雜交瘤細胞株1C11、其產生的抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體及其應用。

背景技術

黃曲霉毒素主要是由黃曲霉和寄生曲霉分泌產生的次生代謝產物，是能引起人畜各種損害的天然有毒化合物。黃曲霉毒素目前已發現20余種，其中最主要的是黃曲霉毒素B1，B2，G1和G2。

黃曲霉毒素污染食品及飼料后，直接或間接進入人類食品鏈，威脅人類的健康和生命安全，危害程度與黃曲霉毒素的攝入量成正比。黃曲霉毒素廣泛存在于大米、玉米、花生、芝麻、大豆、菜籽等農產品和魚肉等食品中，而且往往是多種黃曲霉毒素同時存在，為此世界各國都規定了黃曲霉毒素總量(B1+B2+G1+G2)在食品及飼料中的最大允許含量并作為強制性標準。我國屬于黃曲霉毒素污染較重的地區，因此加強對食品及飼料中黃曲霉毒素總量的檢測、特別是速測，及時了解和掌握食品及飼料的衛生信息，對保障我國食品消費安全具有重要意義。

現有黃曲霉毒素的檢測方法包括薄層層析法、精密儀器分析法和免疫學分析法。其中薄層層析法是檢測黃曲霉毒素最常用的檢測方法，其不需要特殊的儀器設備，一股實驗室都可進行，但試劑用量大、操作繁瑣、其它組分干擾嚴重、準確性差，不能準確定量，且對實驗人員和周圍環境污染危害較大，不適于現場快速檢測。精密儀器分析法包括熒光分光光度法和高效液相色譜法，其靈敏度高，準確性好，但儀器昂貴，要求黃曲霉毒素樣品純化程度高，樣品前處理過程繁瑣，耗時長，對實驗環境要求高，難以實現快速檢測。近些年發展起來的免疫分析技術克服了前兩者的缺點，具有特異性強、靈敏度高、樣品前處理簡單、成本低、對實驗人員和周圍環境的污染危害小、適于現場批量檢測等優點。免疫分析是利用抗原和抗體的特異性的結合反應和抗體、抗原上的標記物的生物、物理或化學放大作用來對超微量殘留物進行定性、定量檢測，所以，要研究建立針對黃曲霉毒素總量的任何一種免疫學檢測技術，都必須先制得抗黃曲霉毒素總量的抗體。目前，國內外已有很多針對單一組分的黃曲霉毒素單克隆或多克隆抗體的報道，但針對黃曲霉毒素總量的抗體尚未見報道。

發明內容

本發明所要解決的問題是提供雜交瘤細胞株1C11、其產生的抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體及其應用。

本發明提供了雜交瘤細胞株1C11，該細胞株已于2010年7月13日保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中國，武漢，武漢大學，保藏編號為CCTCC?NO.C201013。其具有序列表中SEQ?Gene?NO.1所示的抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體重鏈可變區編碼基因序列和序列表中SEQ?Gene?NO.2所示的抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體輕鏈可變區編碼基因序列。

抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體，它由保藏編號為CCTCC?NO.C201013的雜交瘤細胞株1C11分泌產生。其重鏈可變區具有序列表中SEQ?Protein?NO.1所示的氨基酸序列；輕鏈可變區具有序列表中SEQ?Protein?NO.2所示的氨基酸序列。該抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體可以識別黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2。

抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體在黃曲霉毒素總量測定中的應用。

本發明提供的雜交瘤細胞株1C11是采用兩步篩選法獲得的，其具體步驟為：將BALB/c小鼠經黃曲霉毒素完全抗原AFB1-BSA免疫4-6次后，用2倍于前一次免疫劑量的黃曲霉毒素完全抗原AFB1-BSA作最后一次加強免疫，3天后進行細胞融合，采用ELISA方法分兩步進行篩選融合細胞：第一步采用間接ELISA法篩選出抗黃曲霉毒素而不抗載體蛋白BSA的陽性孔；第二步采用間接競爭ELISA法對第一步篩選出的陽性孔培養液進行檢測，用黃曲霉毒素B1，B2，G1和G2共4種作為競爭原，選擇吸光值和靈敏度均較高的孔，采用有限稀釋法進行克隆，克隆后10天左右采用同樣的兩步篩選法進行檢測，如此重復克隆2-3次后，最終篩選獲得雜交瘤細胞株1C11。

本發明提供的抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體的制備方法，步驟如下：將獲得的雜交瘤細胞株1C11注射預先用福氏不完全佐劑處理過的BALB/c小鼠，收集含有抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體的小鼠腹水，純化即得抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體。

本發明的有益效果在于：

(1)本發明提供的雜交瘤細胞株1C11可以用于制備高效價黃曲霉毒素抗體，鼠腹水抗體酶聯免疫吸附分析(ELISA)法測得的效價可達5.12×10⁶，即鼠腹水抗體稀釋5.12×10⁶倍時的溶液測定結果為陽性。