[發明專利]一種重組蛋白A基因及其表達產物的制備方法和用途

有效

• 申請號: 201010245004.8
• 申請日: 2007-03-14
• 公開（公告）號: CN101935665A
• 公開（公告）日: 2011-01-05
• 發明（設計）人: 談珉;胡輝;郭亞軍
• 申請（專利權）人: 上海國健生物技術研究院
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N15/70;C07K14/31;C07K1/22;G01N33/53
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本發明為發明名稱為：一種重組蛋白A基因及其表達產物的制備方法和用途，申請號為：200710085148.X的中國專利申請的分案申請。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體的說，涉及一種重組蛋白A基因，以及含有這種重組基因的載體、轉化的菌株和重組蛋白A基因表達的產物，及其制備方法和用途。

背景技術

葡萄球菌蛋白A(Staphylococal?Protein?A，SPA)是一種從金黃色葡萄球菌細胞壁分離的蛋白質。1940年，Vevwey發現在某些金黃色葡萄球菌中，含有一種物質，在雙向擴散試驗中，能與正常人血清形成沉淀。Jensen(1959)也發現了類似現象，將其命名為A抗原。

1963年Lofkvist等分離了A抗原，并證明它是一種蛋白質，且與糖有區別；Grov(1960)將其命名為葡萄球菌蛋白A，簡稱SPA蛋白A(ProteinA)。編碼SPA的基因于1983年被克隆并在大腸桿菌中表達(Duggleby，C.J?and?Jones，SA：cloning?and?expression?of?the?Staphylococcus?aureus?protein?A?gene?in?Escherichiacoli.Nucl?Acids?Res.11(1983)3065-3076；Lofdahl，S.，Guss，B.，et?al；Gene?forStaphylococcal?protein?A.Proc.Natl.Acid.Sci.USA?80(1983)697-701)。對SPA結構和功能的研究發現，SPA分子包含A、B、C、D、E五個同源結構域，每個結構域都有能與IgG自主結合的能力。SPA基因有1600bp。

由于葡萄球菌蛋白A上有5個結構域可以與IgG的Fc區結合，具有與大多數哺乳動物IgG的Fc段結合的能力。作為一種親和配基，蛋白A被固定在瓊脂糖上面，它上面的5個結構域就可以與IgG的Fc自由結合，一分子固定的蛋白A可以與兩分子的IgG結合，重組蛋白A其C端有一個胱氨酸，結合IgG的能力更強。重組蛋白A被廣泛應用于單克隆抗體或多克隆抗體的分離純化和檢測。在使用含有proteinA的親和層析技術時，存在親和力低、純化效率低等問題，因此在使用該親和層析技術時，需要一種改進的ProteinA，來實現更高的親和力，提高純化的效果。

發明內容

本發明需要解決的技術問題之一是提供一種新的重組蛋白A的基因序列，以克服現有技術的不足。

本發明需要解決的技術問題之二是提供該重組蛋白A的氨基酸序列，以克服現有技術的不足。

本發明需要解決的技術問題之三是提供含有該重組蛋白A基因的載體。

本發明需要解決的技術問題之四是提供被含有重組蛋白A基因的表達載體轉化宿主細胞。

本發明需要解決的技術問題之五是提供該重組蛋白A的制備方法。

本發明需要解決的技術問題之六是提供該重組蛋白A的用途。

本發明需要解決的技術問題之七是提供一種由該重組蛋白A和層析介質載體組成的親和層析介質。

本發明的技術方案如下：

本發明提供的重組蛋白A基因是以3個人工合成的重組蛋白A基因單體串連而成，5‘端Ala-Asp突變成Val-Asp，以形成AccI酶切位點(GTAGAC)，各重組蛋白A基因單體間以AccI酶切位點相連，其中第一個重組蛋白A基因單體前端加入與表達載體相連的NcoI酶切位點，6個His(用于親和層析，與鎳柱結合，減少純化步驟)和EK酶切位點(將His和DDDDK切去，形成正確的ProteinA)，最后一個重組蛋白A基因單體末端加入中止密碼子TAA和與表達載體pET32a相連的BamH?I酶切位點。該基因由621個核苷酸構成，編碼180個氨基酸。該基因序列及其編碼的氨基酸序列見序列表SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2。

本發明還構建了含有上述重組蛋白A基因的載體，這些載體的構建方法是按照常規方法，將通過人工合成的重組蛋白A基因單體酶切后接入相應載體的相應酶切位點之間，再以Acc?I內切酶酶切，連接成包含多個串連重組蛋白A基因單體的重組蛋白A基因表達載體。

上述含重組蛋白A基因的大腸桿菌表達載體優先由本發明合成的重組蛋白A基因與大腸桿菌表達載體PET32構建成的重組表達載體，命名為pET32a-P。

本發明還提供了利用上述含大腸桿菌重組表達載體的大腸桿菌重組株生產重組蛋白A的方法，該方法是將菌種進行培養發酵使其高效表達重組蛋白A，再收集菌體，經分離純化得到重組蛋白A產品。