[發(fā)明專利]一種重組蛋白A基因及其表達(dá)產(chǎn)物的制備方法和用途

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010245004.8
• 申請(qǐng)日: 2007-03-14
• 公開（公告）號(hào): CN101935665A
• 公開（公告）日: 2011-01-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 談珉;胡輝;郭亞軍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海國(guó)健生物技術(shù)研究院
• 主分類號(hào): C12N15/31
• 分類號(hào): C12N15/31;C12N15/70;C07K14/31;C07K1/22;G01N33/53
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一種重組蛋白A親和層析介質(zhì)的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下步驟：

(1)通過化學(xué)合成的方法設(shè)計(jì)合成重組蛋白A基因單體，5‘端Ala-Asp突變成Val-Asp，以形成AccI酶切位點(diǎn)，各重組蛋白A基因單體間以AccI酶切位點(diǎn)相連，第一個(gè)重組蛋白A基因單體前端加入與表達(dá)載體相連的NcoI酶切位點(diǎn)，6個(gè)His和EK酶切位點(diǎn)，最后一個(gè)重組蛋白A基因單體末端加入中止密碼子TAA和與表達(dá)載體pET32a相連的BamH?I酶切位點(diǎn)；

(2)將步驟(1)的重組蛋白A基因單體酶切后接入載體pET32a的相應(yīng)酶切位點(diǎn)之間，再以Acc?I內(nèi)切酶酶切，連接成包含3個(gè)串連重組蛋白A基因單體的重組蛋白A基因表達(dá)載體pET32a-P；

(3)將步驟(2)的表達(dá)載體pET32a-P轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21/DE3，篩選、酶切，獲得重組轉(zhuǎn)化子BL21/pET32a；

(4)將步驟(3)的菌株BL21/pET32a進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)酵，使其高效表達(dá)重組蛋白A，再收集菌體，經(jīng)分離、純化得到重組蛋白A產(chǎn)品；

(5)用環(huán)氧氯丙烷、氫氧化鈉與瓊脂糖或葡聚糖凝膠在水介質(zhì)中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物與步驟(4)獲得的重組蛋白A在5-25℃溫度下反應(yīng)15-20小時(shí)，反應(yīng)完后清洗再抽干，獲得重組蛋白A凝膠。

如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(5)瓊脂糖凝膠為5％的交聯(lián)瓊脂糖凝膠。

如權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的制備方法獲得的重組蛋白A，具有SEQ?IDNO.1所示的氨基酸序列。

如權(quán)利要求3所述的重組蛋白A，具有SEQ?ID?NO.2所示的核苷酸序列。

如權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的制備方法獲得的重組蛋白A親和層析介質(zhì)，其中重組蛋白A具有SEQ?ID?NO.1所示的氨基酸序列。

如權(quán)利要求5所述的重組蛋白A親和層析介質(zhì)，其中重組蛋白A具有SEQ?ID?NO.2所示的核苷酸序列。

如權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的制備方法獲得的重組蛋白A親和層析介質(zhì)的用途，其特征在于，所述重組蛋白A親和層析介質(zhì)用于抗體分離純化。

如權(quán)利要求3-4中任一項(xiàng)所述的重組蛋白A的用途，其特征在于，所述重組蛋白A用于抗體檢測(cè)。

如權(quán)利要求5-6中任一項(xiàng)所述的重組蛋白A親和層析介質(zhì)的用途，其特征在于，所述重組蛋白A親和層析介質(zhì)用于抗體分離純化。