[發(fā)明專利]一種人卵丘細(xì)胞飼養(yǎng)層培養(yǎng)干細(xì)胞的方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010244744.X
• 申請(qǐng)日: 2010-08-04
• 公開（公告）號(hào): CN101892193A
• 公開（公告）日: 2010-11-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李娟;李放;王磊光;魏斌;王洪巖;邱毅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究所
• 主分類號(hào): C12N5/0735
• 分類號(hào): C12N5/0735
• 代理公司: 山東濟(jì)南齊魯科技專利事務(wù)所有限公司 37108
• 代理人: 宋永麗

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及培養(yǎng)干細(xì)胞的方法，是一種人卵丘細(xì)胞飼養(yǎng)層培養(yǎng)干細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)

目前，人胚胎干細(xì)胞主要是培養(yǎng)在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上，這種培養(yǎng)干細(xì)胞的方法雖然穩(wěn)定性較好，但是，鼠的飼養(yǎng)層不符合臨床應(yīng)用要求，存在傳播異種病源體的潛在危險(xiǎn)。為此，人源性細(xì)胞制備的飼養(yǎng)層為本領(lǐng)域技術(shù)人員近幾年研究的主要課題，報(bào)道稱，人源性飼養(yǎng)層細(xì)胞來源可以有皮膚、肺、包皮及胚胎來源的成纖維細(xì)胞。不同的飼養(yǎng)層制作效果差距很大。例如：包皮標(biāo)本進(jìn)行飼養(yǎng)層制作時(shí)，效果比胚胎來源的成纖維細(xì)胞差等。而且，皮膚、肺、胚胎不易獲得，人胚胎成纖維細(xì)胞還存在倫理問題。因此，如何能夠采用一種易獲得且不存在倫理問題的人源性飼養(yǎng)層細(xì)胞，為臨床應(yīng)用提供可靠的飼養(yǎng)層，是本領(lǐng)域技術(shù)人員目前研究的主要課題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是，提供一種人卵丘細(xì)胞飼養(yǎng)層培養(yǎng)干細(xì)胞的方法，使其細(xì)胞容易獲得，培養(yǎng)方法易于操作，易于推廣在臨床上的應(yīng)用。

本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)上述目的，通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種人卵丘細(xì)胞飼養(yǎng)層培養(yǎng)干細(xì)胞的方法，包括下述步驟：

①采用體外受精胚胎移植技術(shù)治療不孕癥的患者取卵后3-4小時(shí)，卵冠丘復(fù)合體置入80units/ml透明脂酸酶液內(nèi)30秒，用毛細(xì)管吹打脫去卵子周圍的卵丘細(xì)胞，將卵丘細(xì)胞收集離心管中，加卵丘細(xì)胞培養(yǎng)基4-6ml，采用離心機(jī)在1000轉(zhuǎn)速下離心5分鐘，其中透明脂酸酶液中含透明質(zhì)酸酶2.45mg，高糖DMEM培養(yǎng)基10ml；

②將離心后的上清液棄掉，得到卵丘細(xì)胞懸液，在卵丘細(xì)胞懸液內(nèi)加入0.25％胰蛋白酶1ml，混勻后放置1-2分鐘；

③在步驟②中的卵丘細(xì)胞懸液中再加卵丘細(xì)胞的培養(yǎng)基4ml，混勻后，置入1000轉(zhuǎn)的離心機(jī)內(nèi)離心5分鐘；

④將步驟③中離心后的上清液棄掉，在沉淀物中加入卵丘細(xì)胞培養(yǎng)基調(diào)整至密度為5×10⁴/ml，得到卵丘細(xì)胞懸液；

⑤取四孔皿，每孔中加入0.1％明膠0.5ml，在室溫中放置5分鐘后將明膠液體全部吸出后備用；

⑥在步驟⑤中的四孔皿中每孔加1ml步驟④中的卵丘細(xì)胞懸液后，放置在CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)24小時(shí)，CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)的CO₂氣體濃度為5％，CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)的溫度為37℃；

⑦24小時(shí)后在CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)取出四孔皿，吸去卵丘細(xì)胞培養(yǎng)基，更換干細(xì)胞培養(yǎng)基，加干細(xì)胞培養(yǎng)液1ml，每孔加干細(xì)胞6-8團(tuán)，每團(tuán)含干細(xì)胞90-110個(gè)；

⑧對(duì)步驟⑦中的干細(xì)胞培養(yǎng)基每隔1-2天更換50％，4-7天后將長大的胚胎干細(xì)胞團(tuán)用玻璃針挑出每團(tuán)切成4-8塊，用毛細(xì)玻璃管吸出轉(zhuǎn)移到新的卵丘細(xì)胞飼養(yǎng)層內(nèi)培養(yǎng)，新的卵丘細(xì)胞飼養(yǎng)層是按照步驟①-⑥獲得的卵丘細(xì)胞飼養(yǎng)層；

⑨將舊的四孔皿中更換新的干細(xì)胞培養(yǎng)基，當(dāng)殘留的干細(xì)胞團(tuán)再長大時(shí)，重復(fù)步驟⑦的操作，直到卵丘細(xì)胞凋亡，不能維持干細(xì)胞生長。

本發(fā)明所述的一種人卵丘細(xì)胞飼養(yǎng)層培養(yǎng)干細(xì)胞的方法，干細(xì)胞培養(yǎng)基按下述體積比制作：80％胚胎干細(xì)胞用培養(yǎng)基、20％人胚胎干細(xì)胞用血清替代品、1％非必須氨基酸、2mM?L-谷氨酰胺、0.1mM?β-巰基乙醇、4ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長因子、1000IU/ml白血病抑制因子。

本發(fā)明所述卵丘細(xì)胞培養(yǎng)基按下述體積比制成：高糖DMEM培養(yǎng)基90％和滅活胎牛血清10％。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：采用體外受精胚胎移植技術(shù)治療不孕癥的患者的廢棄細(xì)胞，細(xì)胞容易獲得，培養(yǎng)方法操作簡便，方法易于推廣，不需經(jīng)絲裂霉素C或γ射線照射處理，避免了因細(xì)胞死亡，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)可能會(huì)引起胚胎干細(xì)胞的突變及影響正常核型的保持，沒有動(dòng)物源性細(xì)胞污染，不存在傳播異種病源體的潛在危險(xiǎn)。為臨床應(yīng)用提供了可靠的飼養(yǎng)層。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例

本發(fā)明一種人卵丘細(xì)胞飼養(yǎng)層培養(yǎng)干細(xì)胞的方法，包括下述步驟：

①采用體外受精胚胎移植技術(shù)治療不孕癥的患者取卵后3-4小時(shí)，卵冠丘復(fù)合體置入80units/ml透明脂酸酶液內(nèi)30秒，用毛細(xì)管吹打脫去卵子周圍的卵丘細(xì)胞，將卵丘細(xì)胞收集離心管中，加卵丘細(xì)胞培養(yǎng)基4-6ml，采用離心機(jī)在1000轉(zhuǎn)速下離心5分鐘，其中透明脂酸酶液中含透明質(zhì)酸酶2.45mg，高糖DMEM培養(yǎng)基10ml；

②將離心后的上清液棄掉，得到卵丘細(xì)胞懸液，在卵丘細(xì)胞懸液內(nèi)加入0.25％胰蛋白酶1ml，混勻后放置1-2分鐘；