[發明專利]一種人卵丘細胞飼養層培養干細胞的方法

無效

• 申請號: 201010244744.X
• 申請日: 2010-08-04
• 公開（公告）號: CN101892193A
• 公開（公告）日: 2010-11-24
• 發明（設計）人: 李娟;李放;王磊光;魏斌;王洪巖;邱毅
• 申請（專利權）人: 山東省計劃生育科學技術研究所
• 主分類號: C12N5/0735
• 分類號: C12N5/0735
• 代理公司: 山東濟南齊魯科技專利事務所有限公司 37108
• 代理人: 宋永麗

1.一種人卵丘細胞飼養層培養干細胞的方法，其特征在于：包括下述步驟：

①采用體外受精胚胎移植技術治療不孕癥的患者取卵后3-4小時，卵冠丘復合體置入80units/ml透明脂酸酶液內30秒，用毛細管吹打脫去卵子周圍的卵丘細胞，將卵丘細胞收集離心管中，加卵丘細胞培養基4-6ml，采用離心機在1000轉速下離心5分鐘，其中透明脂酸酶液中含透明質酸酶2.45mg，高糖DMEM培養基10ml；

②將離心后的上清液棄掉，得到卵丘細胞懸液，在卵丘細胞懸液內加入0.25％胰蛋白酶1ml，混勻后放置1-2分鐘；

③在步驟②中的卵丘細胞懸液中再加卵丘細胞的培養基4ml，混勻后，置入1000轉的離心機內離心5分鐘；

④將步驟③中離心后的上清液棄掉，在沉淀物中加入卵丘細胞培養基調整至密度為5×10⁴/ml，得到卵丘細胞懸液；

⑤取四孔皿，每孔中加入0.1％明膠0.5ml，在室溫中放置5分鐘后將明膠液體全部吸出后備用；

⑥在步驟⑤中的四孔皿中每孔加1ml步驟④中的卵丘細胞懸液后，放置在CO₂培養箱內24小時，CO₂培養箱內的CO₂氣體濃度為5％，CO₂培養箱內的溫度為37℃；

⑦24小時后在CO₂培養箱內取出四孔皿，吸去卵丘細胞培養基，更換干細胞培養基，加干細胞培養液1ml，每孔加干細胞6-8團，每團含干細胞90-110個；

⑧對步驟⑦中的干細胞培養基每隔1-2天更換50％，4-7天后將長大的胚胎干細胞團用玻璃針挑出每團切成4-8塊，用毛細玻璃管吸出轉移到新的卵丘細胞飼養層內培養，新的卵丘細胞飼養層是按照步驟①-⑥獲得的卵丘細胞飼養層；

⑨將舊的四孔皿中更換新的干細胞培養基，當殘留的干細胞團再長大時，重復步驟⑦的操作，直到卵丘細胞凋亡，不能維持干細胞生長。

2.根據權利要求1所述的一種人卵丘細胞飼養層培養干細胞的方法，其特征在于：干細胞培養基按下述體積比制作：80％胚胎干細胞用培養基、20％人胚胎干細胞用血清替代品、1％非必須氨基酸、2mM?L-谷氨酰胺、0.1mM?β-巰基乙醇、4ng/ml堿性成纖維細胞生長因子、1000IU/ml白血病抑制因子。

3.根據權利要求1所述的一種人卵丘細胞飼養層培養干細胞的方法，其特征在于：所述卵丘細胞培養基按下述體積比制成：高糖DMEM培養基90％和滅活胎牛血清10％。