[發明專利]一種檢測克倫特羅的方法及其專用化學發光免疫試劑盒

有效

• 申請號: 201010244187.1
• 申請日: 2010-08-03
• 公開（公告）號: CN101936984A
• 公開（公告）日: 2011-01-05
• 發明（設計）人: 程林麗;沈建忠;張素霞;王戰輝;史為民;吳聰明;曹興元;湯樹生
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53;G01N33/577;G01N33/531;C07K16/44;C12N5/20;C12R1/91
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;任鳳華

技術領域

本發明涉及一種檢測克倫特羅的方法及其專用化學發光免疫試劑盒。

背景技術

目前動物性食品安全已成為全世界關注的焦點，其中獸藥殘留問題是影響動物性食品安全的最主要因素之一，由于動物樣本成分復雜，待測物濃度較低，而且大多數取樣量很少，這就對分析方法的選擇性和靈敏度提出了更高的要求。化學發光免疫分析(Chemiluminescence?analysis，CLlA)技術將高靈敏的化學發光技術與高特異性的免疫反應結合起來，具有靈敏度高、特異性強、線性范圍寬、操作簡便、不需要十分昂貴的儀器設備等特點。CLIA不需要外來光源，具有比熒光免疫分析更高的信噪比，比常規的酶聯免疫吸附檢測方法的抗背景干擾能力強，其靈敏度比ELISA高1至2個數量級，檢測范圍可達6個數量級，自動化程度高，提高了分析方法的精密度，CLIA已經成為一種先進的痕量或超痕量物質的檢測技術。CLIA在獸醫學、醫學、食品分析等方面將會有更廣闊的應用前景。

克倫特羅(Clenbuterol，CLE)是一種β-腎上腺素受體激動劑，具有松弛支氣管平滑肌的作用，主要用于治療豬、牛等的支氣管哮喘等疾病。當使用量為臨床治療劑量的5-10倍時，具有促進蛋白質合成和脂肪分解的作用，可顯著體高胴體瘦肉率和飼料報酬，且對豬的飼養效應尤為明顯。但是，克倫特羅毒副作用較大，歐盟和中國等國家均禁止其作為飼料添加劑使用，一些不法分子不顧消費者的健康安全，仍將其利用于畜牧生產中，導致其在畜禽產品中殘留，危害公眾健康。動物組織中克倫特羅殘留的檢測方法主要采用氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜-質譜法、液相色譜-聯質譜法、酶聯免疫法等。

發明內容

本發明的一個目的是提供一種檢測克倫特羅的專用化學發光免疫試劑盒。

本發明提供的一種檢測克倫特羅的化學發光免疫試劑盒，包括克倫特羅特異性抗體、包被原和標準品溶液；所述包被原為克倫特羅半抗原與載體蛋白的偶聯物；其結

(式I)。

所述試劑盒還包括發光液、濃縮洗滌液、濃縮復溶液、包被緩沖液、封閉液和酶標抗抗體；

所述試劑盒由克倫特羅特異性抗體、包被原、標準品溶液、發光液、濃縮洗滌液、濃縮復溶液、包被緩沖液、封閉液和酶標抗抗體組成。

所述克倫特羅特異性抗體為克倫特羅單克隆抗體或克倫特羅多克隆抗體，所述克倫特羅單克隆抗體是由保藏號為CGMCC?No.3777的對克倫特羅的單克隆雜交瘤細胞株CLE分泌的抗體。

所述標準品溶液中標準品的濃度為0μg/L、0.1μg/L、0.5μg/L、1μg/L、10μg/L或100μg/L，所述標準品為克倫特羅；

所述發光液由A液和B液組成，發光液A液為過氧化氫；發光液B液為魯米諾溶液；

所述濃縮洗滌液是將0.05g疊氮化鈉和100mL濃度為0.02M、pH為7.4的磷酸鹽緩沖液混合得到溶液；

所述濃縮復溶液是將0.1g牛血清白蛋白和100mL濃度為0.05mol/L、pH為7.4的磷酸鹽緩沖液混合得到的溶液；

所述包被緩沖液是pH值為9.6的濃度為0.03mol/L的碳酸鹽緩沖液；

所述封閉液是將0.01g疊氮化鈉、10g牛血清白蛋白和100mL濃度為0.03mol/L、pH值為7.4磷酸鹽溶液混合得到的溶液。

所述包被原是按照如下方法制備得到的：a、將每5mg克倫特羅半抗原加入2mL0.5M的硫酸水溶液中，得到的溶液稱為A液；將每50mg的載體蛋白溶于4mL濃度為100mg/mL的碳酸鈉水溶液中，得到的溶液稱為B液；將每30mg亞硝酸鈉溶于1mL水得到的溶液稱為C液；在0℃條件下，將C液加入到A液中得到的混合物稱為D液；

b、將D液逐滴加入到B液中，得到D液和B液的混合液；逐滴加入的方式為從開始加入時計起，6min后開始攪拌混合液，并使混合液的pH保持在9-10之間，滴加完畢后，繼續攪拌反應4h，將得到的產物透析，得到所述包被原；

所述克倫特羅半抗原的結構式如式II所示：

(式II)。

所述克倫特羅半抗原為克倫特羅。

所述載體蛋白為鼠血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白或血藍蛋白，優選為卵清蛋白；

所述酶標抗抗體為辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗抗體。

本發明的另一個目的是提供一種檢測克倫特羅的方法。

本發明提供的方法包括以下步驟：

1)樣品前處理：