[發明專利]一種檢測克倫特羅的方法及其專用化學發光免疫試劑盒

有效

• 申請號: 201010244187.1
• 申請日: 2010-08-03
• 公開（公告）號: CN101936984A
• 公開（公告）日: 2011-01-05
• 發明（設計）人: 程林麗;沈建忠;張素霞;王戰輝;史為民;吳聰明;曹興元;湯樹生
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53;G01N33/577;G01N33/531;C07K16/44;C12N5/20;C12R1/91
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;任鳳華

1.一種檢測克倫特羅的化學發光免疫試劑盒，包括克倫特羅特異性抗體、包被原和標準品溶液；所述包被原為克倫特羅半抗原與載體蛋白的偶聯物；其結構式如式I所示：

????????????????????????????????????????????????????????????(式I)。

2.根據權利要求1所述的化學發光免疫試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包括發光液、濃縮洗滌液、濃縮復溶液、包被緩沖液、封閉液和酶標抗抗體；

所述試劑盒由克倫特羅特異性抗體、包被原、標準品溶液、發光液、濃縮洗滌液、濃縮復溶液、包被緩沖液、封閉液和酶標抗抗體組成。

3.根據權利要求1或2所述的化學發光免疫試劑盒，其特征在于：所述克倫特羅特異性抗體為克倫特羅單克隆抗體或克倫特羅多克隆抗體，所述克倫特羅單克隆抗體是由保藏號為CGMCC?No.3777的對克倫特羅的單克隆雜交瘤細胞株CLE分泌的抗體。

4.根據權利要求1-3中任一所述的化學發光免疫試劑盒，其特征在于：所述標準品溶液中標準品的濃度為0μg/L、0.1μg/L、0.5μg/L、1μg/L、10μg/L或100μg/L，所述標準品為克倫特羅；

所述發光液由A液和B液組成，發光液A液為過氧化氫；發光液B液為魯米諾溶液；

所述濃縮洗滌液是將0.05g疊氮化鈉和100mL濃度為0.02M、pH為7.4的磷酸鹽緩沖液混合得到溶液；

所述濃縮復溶液是將0.1g牛血清白蛋白和100mL濃度為0.05mol/L、pH為7.4的磷酸鹽緩沖液混合得到的溶液；

所述包被緩沖液是pH值為9.6的濃度為0.03mol/L的碳酸鹽緩沖液；

所述封閉液是將0.01g疊氮化鈉、10g牛血清白蛋白和100mL濃度為0.03mol/L、pH值為7.4磷酸鹽溶液混合得到的溶液。

5.根據權利要求1-4中任一所述的化學發光免疫試劑盒，其特征在于：

所述包被原是按照如下方法制備得到的：a、將每5mg克倫特羅半抗原加入2mL0.5M的硫酸水溶液中，得到的溶液稱為A液；將每50mg的載體蛋白溶于4mL濃度為100mg/mL的碳酸鈉水溶液中，得到的溶液稱為B液；將每30mg亞硝酸鈉溶于1mL水得到的溶液稱為C液；在0℃條件下，將C液加入到A液中得到的混合物稱為D液；

b、將D液逐滴加入到B液中，得到D液和B液的混合液；逐滴加入的方式為從開始加入時計起，6min后開始攪拌混合液，并使混合液的pH保持在9-10之間，滴加完畢后，繼續攪拌反應4h，將得到的產物透析，得到所述包被原；

所述克倫特羅半抗原的結構式如式II所示：

????????????????????????????????????????????????(式II)。

6.根據權利要求1-5中任一所述的化學發光免疫試劑盒，其特征在于：所述克倫特羅半抗原為克倫特羅。

7.根據權利要求1-6中任一所述的化學發光免疫試劑盒，其特征在于：

所述載體蛋白為鼠血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白或血藍蛋白，優選為卵清蛋白；

所述酶標抗抗體為辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗抗體。

8.一種檢測克倫特羅的方法，包括以下步驟：

1)樣品前處理：

將每2g動物組織勻漿后，加入10mL?0.1M高氯酸水溶液，振蕩混合10min，以3000g的速度離心5min，將2mL上清液的pH值調至11，加入2mL乙酸乙酯與異丙醇混合液混勻，3000g離心5min，取上層有機相氮氣吹干，加入1mL復溶液溶解殘留物，獲得待測樣本溶液；所述乙酸乙酯與異丙醇混合液是由體積比為8∶2的乙酸乙酯與異丙醇混合得到的；所述動物組織為豬肉或豬肝；

或：取每10mL豬尿以3000g離心5min；取上清液，用復溶液稀釋5倍后獲得待測樣本溶液；

所述復溶液為將所述濃縮復溶液用0.05mol/L、pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋10倍得到的；

2)利用權利要求1-7中任一所述的檢測克倫特羅的化學發光免疫試劑盒檢測步驟1)中的樣本溶液。

9.由保藏號為CGMCC?No.3777的對克倫特羅的單克隆雜交瘤細胞株CLE分泌的克倫特羅單克隆抗體。

10.保藏號為CGMCC?No.3777的對克倫特羅的單克隆雜交瘤細胞株CLE。