[發(fā)明專利]豬藍(lán)耳病病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010244093.4
• 申請(qǐng)日: 2010-07-27
• 公開（公告）號(hào): CN101899535A
• 公開（公告）日: 2010-12-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳林鳳;潘振華;張紅;盛青松
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 無錫奧瑞生物醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 無錫市大為專利商標(biāo)事務(wù)所 32104
• 代理人: 曹祖良

技術(shù)領(lǐng)域

一種豬藍(lán)耳病病毒(PRRS)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))檢測(cè)方法，涉及一種病毒檢測(cè)方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

豬藍(lán)耳病病毒(PRRS)是單股正鏈RNA病毒，屬套式病毒目，動(dòng)脈炎病毒科，動(dòng)脈炎病毒屬。該病毒可引起豬繁殖與呼吸綜合癥，是一種高度傳染性疾病，1987年首次在美國(guó)爆發(fā)，現(xiàn)已成為全球范圍內(nèi)流行的、危害性最大的豬傳染性疾病。

豬藍(lán)耳病又稱“豬繁殖與呼吸障礙綜合癥”，是由豬繁殖與呼吸障礙綜合癥病毒引起，以成年豬生殖障礙、早產(chǎn)、流產(chǎn)和死胎，以及仔豬呼吸異常為特癥的傳染病，是一種免疫抑制病，常常繼發(fā)其他病原感染。

目前，檢測(cè)豬病毒的方法很多，如血清學(xué)實(shí)驗(yàn)、組織塊培養(yǎng)和共培技術(shù)、核酸雜交和常規(guī)PCR檢測(cè)技術(shù)等，其中常規(guī)PCR檢測(cè)技術(shù)敏感性、特異性、穩(wěn)定性和可操作性都比較好，但常規(guī)PCR反應(yīng)后的處理存在交叉污染，也比較容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果，并且實(shí)驗(yàn)時(shí)間也相對(duì)較長(zhǎng)。而實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)就彌補(bǔ)了以上的缺陷，無論是在研究中還是在臨床樣品的檢測(cè)上，實(shí)時(shí)熒光定量PCR快速、敏感的特性使它成為應(yīng)用于檢測(cè)微生物的有效方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)PCR的高靈敏性、DNA雜交的高特異性和光譜技術(shù)的高精確性；(2)儀器自動(dòng)分析，效率高、無后續(xù)處理；(3)獨(dú)特的定量原理，即時(shí)反映擴(kuò)增過程，摒棄終點(diǎn)數(shù)據(jù)，更適用于定量，結(jié)果重現(xiàn)性好；(4)采用dUTP-UNG酶的防污染系統(tǒng)，所有試劑均是一次擴(kuò)增，毋須開蓋，不產(chǎn)生污染。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種豬藍(lán)耳病病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述不足，本發(fā)明檢測(cè)方法的檢測(cè)靈敏度可達(dá)到1.0×10⁴個(gè)拷貝的病毒分子，對(duì)于單個(gè)樣本檢測(cè)時(shí)間為2個(gè)小時(shí)，可同時(shí)進(jìn)行大批量的樣本分析，具有良好的特異性、敏感性、重復(fù)性和穩(wěn)定性，適用于病毒感染的前期診斷。

本發(fā)明的技術(shù)方案：豬藍(lán)耳病病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，步驟如下：

1、標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建：在美國(guó)國(guó)立生物信息中心NCBI基因庫(kù)Genbank中檢索獲得豬藍(lán)耳病病毒的保守基因，基因片段從11271～11387，序列(SEQ?ID?NO：4)為：GGGGGATGTCATCACGTTACCTCCAAATACCTTCCGCGCTTCCTTCCCAAGGAATCAGTTGCGGTGGTCGGGGTTTCGAGCCCCGGGAAAGCCGCGAAAGCAGTTTGCACATTGACG；利用基因克隆技術(shù)構(gòu)建含有該保守序列的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子，所用的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為PUC57，由金斯瑞公司提供合成；

2、特異性引物及熒光探針的設(shè)計(jì)：以步驟1中選取的高度保守序列為基準(zhǔn)，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物及一條熒光探針；設(shè)計(jì)原則為：每條引物的長(zhǎng)度為18～25個(gè)堿基，熒光探針長(zhǎng)度為20～30個(gè)堿基；特異性引物和熒光探針中GC含量要求在40％～60％，理論Tm＞50℃；特異性引物和熒光探針自身以及特異性引物和熒光探針之間的3’端避免堿基配對(duì)；選用的特異性引物和熒光探針要設(shè)計(jì)在豬藍(lán)耳病病毒基因中的保守區(qū)，只對(duì)豬藍(lán)耳病病毒特異，和其他物種無交叉反應(yīng)；熒光探針應(yīng)位于一對(duì)特異性引物之間的區(qū)域；根據(jù)PRRSV全序列(GenBank號(hào)為EF488048)，在PRRSV基因組ORF1b編碼區(qū)，應(yīng)用primer?express?3.0軟件在其保守區(qū)設(shè)計(jì)如下引物和探針：

所述特異性引物包含有正向引物(PrimerF)、反向引物(PrimerR)，其中正向引物的序列為：5’-GGGGGATGTCATCACGTTAC-3’(nt?11271～nt?11290)，反向引物的序列為：5’-CGTCAATGTGCAAACTGCTT-3’(nt?11387～nt?11368)；

所述熒光探針的序列為：5’-FAM-CGCGCTTCCTTCCCAAGGAATC-TAMRA-3’(nt?11305～nt?11326)。

3、實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增及建立檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線，包括步驟：

(1)模板的制備：

將步驟1中構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作10倍系列稀釋成標(biāo)準(zhǔn)液，以標(biāo)準(zhǔn)液為模板；具體如下：定量標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為2.94×10⁹拷貝/μl，用稀釋液將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒按10倍稀釋，即稀釋成濃度分別為1.0×10⁸、1.0×10⁷、1.0×10⁶、1.0×10⁵、1.0×10⁴的標(biāo)準(zhǔn)液，標(biāo)準(zhǔn)液在-20℃條件下保存?zhèn)溆茫?/p>