[發(fā)明專利]豬藍(lán)耳病病毒實(shí)時熒光定量PCR檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010244093.4
• 申請日: 2010-07-27
• 公開（公告）號: CN101899535A
• 公開（公告）日: 2010-12-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳林鳳;潘振華;張紅;盛青松
• 申請（專利權(quán)）人: 無錫奧瑞生物醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 無錫市大為專利商標(biāo)事務(wù)所 32104
• 代理人: 曹祖良

1.豬藍(lán)耳病病毒實(shí)時熒光定量PCR檢測方法，其特征在于標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建、特異性引物及熒光探針的設(shè)計(jì)、實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增及建立檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線、感染病毒樣本的RNA提取及cDNA的制備、有效性驗(yàn)證及結(jié)果檢測判定；

(1)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建：在美國國立生物信息中心NCBI基因庫Genbank中檢索獲得豬藍(lán)耳病病毒的保守基因，基因片段從11271～11387，序列為：GGGGGATGTCATCACGTTACCTCCAAATACCTTCCGCGCTTCCTTCCCAAGGAATCAGTTGCGGTGGTCGGGGTTTCGAGCCCCGGGAAAGCCGCGAAAGCAGTTTGCACATTGACG；利用基因克隆技術(shù)構(gòu)建含有該保守序列的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子，所用的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為PUC57，由金斯瑞公司提供合成；

(2)特異性引物及熒光探針的設(shè)計(jì)：

正向引物PrimerF：5’-GGGGGATGTCATCACGTTAC-3’，

反向引物PrimerR：5’-CGTCAATGTGCAAACTGCTT-3’；

熒光探針的序列：5’-FAM-CGCGCTTCCTTCCCAAGGAATC-TAMRA-3’；

(3)實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增及建立檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線，步驟為：

(a)模板的制備：

定量標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為2.94×10⁹拷貝/μl，用稀釋液將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒稀釋，即稀釋成濃度分別為1.0×10⁸、1.0×10⁷、1.0×10⁶、1.0×10⁵、1.0×10⁴拷貝/μl的標(biāo)準(zhǔn)液，標(biāo)準(zhǔn)液在-20℃條件下保存?zhèn)溆茫?/p>

(b)實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增：

25μl的PCR反應(yīng)體系含有成分如下：DEPC水，15.75μl；10×PCR?buffer，2.5μl；10mM?dNTPs，0.5μl；1.25U?Taq?DNA聚合酶，0.25μl；300nM?PrimerF，2.5μl；300nM?PrimerR，2.5μl；模板，1μl；

將加樣后的PCR試劑管放入熒光PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)循環(huán)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min，1個循環(huán)；95℃變性20s、55℃退火30s、72℃延伸30s，40個循環(huán)后，得到反應(yīng)產(chǎn)物；

(c)建立檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線：熒光PCR儀采集熒光信號，經(jīng)計(jì)算機(jī)軟件自動生成以起始模板數(shù)對數(shù)為x軸，C_T值為y軸的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

(4)有效性驗(yàn)證及結(jié)果檢測判定，步驟為：

(a)利用未感染豬藍(lán)耳病病毒PRRS豬的cDNA配制陰性對照PCR反應(yīng)體系：25μl的陰性對照PCR反應(yīng)體系為含有成分如下：DEPC水，15.75μl；10×PCR?buffer，2.5μl；10mM?dNTPs，0.5μl；1.25U?Taq?DNA聚合酶，0.25μl；300nM?PrimerF，2.5μl；300nM?PrimerR，2.5μl；未感染PRRS豬的cDNA，1μl；

利用感染PRRS豬的cDNA制備陽性對照PCR反應(yīng)體系：25μl的陽性對照PCR反應(yīng)體系為含有成分如下：DEPC水，15.75μl；10×PCR?buffer，2.5μl；10mM?dNTPs，0.5μl；1.25U?Taq?DNA聚合酶，0.25μl；300nM?PrimerF，2.5μl；300nM?PrimerR，2.5μl；感染PRRS豬的cDNA，1μl；

(b)循環(huán)反應(yīng)：

將加好樣的陰性對照和陽性對照的PCR試劑管同時放入熒光PCR儀中，進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)循環(huán)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min，1個循環(huán)；95℃變性20s、55℃退火30s、72℃延伸30s，40個循環(huán)后反應(yīng)結(jié)束，得到反應(yīng)產(chǎn)物；

(c)有效性驗(yàn)證：

熒光PCR儀采集熒光信號，經(jīng)計(jì)算機(jī)軟件生成陰性對照點(diǎn)和陽性對照點(diǎn)；陰性對照點(diǎn)應(yīng)無C_T值并且無擴(kuò)增曲線，陽性對照點(diǎn)應(yīng)位于標(biāo)準(zhǔn)曲線上，并且其C_T值應(yīng)＜32，否則重做。