[發(fā)明專利]一種提取連翹葉片DNA的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010243515.6
• 申請(qǐng)日: 2010-08-03
• 公開（公告）號(hào): CN101914525A
• 公開（公告）日: 2010-12-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馮衛(wèi)生;陳隨清;董誠明;蘇秀紅;李漢偉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 河南中醫(yī)學(xué)院
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10
• 代理公司: 鄭州天陽專利事務(wù)所(普通合伙) 41113
• 代理人: 聶孟民

一、技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及醫(yī)藥，特別是一種提取連翹葉片DNA的方法。

二、背景技術(shù)

連翹(Forsythia?suspensa(Thunb.)Vah1)為木犀科(Oleaceae)連翹屬(Forsythia)多年生落葉灌木，果實(shí)初熟尚帶綠色時(shí)采收稱為青翹，果實(shí)熟透顏色發(fā)黃時(shí)采收稱為老翹，具有清熱解毒、消腫散結(jié)之功效。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，目前DNA標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)滲透到中藥的各個(gè)領(lǐng)域，而DNA提取技術(shù)是分子標(biāo)記技術(shù)的關(guān)鍵。連翹葉片內(nèi)含有較多的酚類、鞣質(zhì)類物質(zhì)，這些次生代謝物的存在嚴(yán)重影響了DNA的純度，進(jìn)而影響到其后續(xù)的DNA擴(kuò)增工作。因而連翹DNA的提取是分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用其研究中的重中之重。

電泳檢測(cè)表明經(jīng)典的CTAB法提取出來的DNA含有少量的蛋白，并且DNA條帶彌散，A_260/280＝1.38，所提取DNA中因純度低，連翹葉片內(nèi)含有過多的酚類、鞣質(zhì)等雜質(zhì)，對(duì)其后續(xù)分子標(biāo)記技術(shù)的研究造成很大的影響，因此很有必要對(duì)連翹DNA提取方法進(jìn)行改進(jìn)。

三、發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)上述情況，為克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，本發(fā)明之目的就是提供一種提取連翹葉片DNA的方法，可有效克服連翹DNA的含有少量的蛋白，并且DNA條帶彌散，A_260/280＝1.38，并消除連翹葉片內(nèi)過多的酚類、鞣質(zhì)等雜質(zhì)對(duì)連翹DNA影響造成的純度低問題。

本發(fā)明解決的技術(shù)方案是，以連翹幼嫩葉片為材料，在研缽中加液氮迅速研磨成粉末(必要時(shí)，在加液氮之前，可先在研缽中加入0.05gPVP)，之后將粉末轉(zhuǎn)入滅菌離心管中，加入0-4℃預(yù)冷的提取緩沖液I，提取緩沖液I加入量為連翹幼嫩葉片重量體積的6-10倍，(所說的重量體積為連翹幼嫩葉片以重量g計(jì)，提取緩沖液I以體積ml計(jì)，以下同)，連翹幼嫩葉片加液氮迅速研磨成的粉末與提取緩沖液I混勻，冰浴10min，4℃下離心10min，棄去上清液，得離心后的沉淀物，沉淀物中加入提取緩沖液II，提取緩沖液II加入量為原連翹幼嫩葉片重量體積的6倍，沉淀物與提取緩沖液II混勻，冰浴10min，4℃下離心10min，棄去上清液，立即加入預(yù)熱的2×CTAB和β-巰基乙醇，2×CTAB加入量為連翹幼嫩葉片重量體積的6-10倍，β-巰基乙醇加入量為每0.5g連翹幼嫩葉片原材料加入60-120μL，充分混勻，在65℃水浴中保溫4h期間每隔0.5h輕輕搖動(dòng)離心管一次；水浴后，4℃下離心10min；取上清液置滅菌離心管中，加入與上清液等體積的氯仿和異戊醇的混合溶液，其混合溶液的配比是氯仿和異戊醇體積比24∶1，輕輕顛倒離心管，混勻，4℃下離心10min，重復(fù)此操作，至上清液與氯仿和異戊醇混合溶液的液面無白色沉淀為止；把上清液轉(zhuǎn)移到滅菌離心管中，加入2/3倍量上清液體積、并于-20℃預(yù)冷的異丙醇，輕輕晃動(dòng)，于-20℃靜置過夜(8-12小時(shí))；4℃下離心5min，收集沉淀，棄去上清液，用75％(V/V)的乙醇漂洗沉淀2-3次，每次用量為連翹幼嫩葉片原材料重量體積的2倍，將離心管倒置在吸水紙上，風(fēng)干，得風(fēng)干物；每0.5g連翹幼嫩葉片原材料制得的風(fēng)干物用50-60μLTE緩沖液溶解，并加入0.5μL?5-10mg/mLRNase，輕輕混勻，于37℃水浴中溫浴30min，即得到高質(zhì)量的可直接用于PCR擴(kuò)增的連翹葉片基因組DNA；

所說的提取緩沖液I是由0.25mol/L?Tris-HCl、50mmol/L?EDTA、0.25mol/LNaCl和余量為水混合均勻制成；所說的提取緩沖液II是由100mmol/LTris-HCl，20mmol/L?EDTA，0.25mol/L?NaCl，0.025mol/L?Na₂B₄O₇和余量為水混合均勻制成。

本發(fā)明有效用于提取連翹葉片DNA，提出物純度高，效率高，有效克服了電泳檢測(cè)表明經(jīng)典的CTAB法提取出來的DNA含有少量的蛋白，并且DNA條帶彌散，A_260/280＝1.38，所提取DNA純度較低的問題，有效保證了對(duì)其后續(xù)分子標(biāo)記技術(shù)的研究創(chuàng)造了良好的技術(shù)條件，是提取連翹葉片DNA的方法的一大創(chuàng)造。

四、具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作詳細(xì)說明。

實(shí)施例1

本發(fā)明在實(shí)施中，具體可由以下步驟實(shí)現(xiàn)：