[發明專利]一種提取連翹葉片DNA的方法

有效

• 申請號: 201010243515.6
• 申請日: 2010-08-03
• 公開（公告）號: CN101914525A
• 公開（公告）日: 2010-12-15
• 發明（設計）人: 馮衛生;陳隨清;董誠明;蘇秀紅;李漢偉
• 申請（專利權）人: 河南中醫學院
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 鄭州天陽專利事務所(普通合伙) 41113
• 代理人: 聶孟民

1.一種提取連翹葉片DNA的方法，其特征在于：以連翹幼嫩葉片為材料，在研缽中加液氮迅速研磨成粉末，之后將粉末轉入滅菌離心管中，加入0-4℃預冷的提取緩沖液I，提取緩沖液I加入量為連翹幼嫩葉片重量體積的6-10倍，，連翹幼嫩葉片加液氮迅速研磨成的粉末與提取緩沖液I混勻，冰浴10min，4℃下離心10min，棄去上清液，得離心后的沉淀物，沉淀物中加入提取緩沖液II，提取緩沖液II加入量為原連翹幼嫩葉片重量體積的6倍，沉淀物與提取緩沖液II混勻，冰浴10min，4℃下離心10min，棄去上清液，立即加入預熱的2×CTAB和β-巰基乙醇，2×CTAB加入量為連翹幼嫩葉片重量體積的6-10倍，β-巰基乙醇加入量為每0.5g連翹幼嫩葉片原材料加入60-120μL，充分混勻，在65℃水浴中保溫4h期間每隔0.5h輕輕搖動離心管一次；溫浴后，4℃下離心10min；取上清液置滅菌離心管中，加入與上清液等體積的氯仿和異戊醇混合溶液，其混合溶液的配比是氯仿和異戊醇體積比24∶1，輕輕顛倒離心管，混勻，4℃下離心10min，重復此操作，至上清液與氯仿和異戊醇混合溶液的液面無白色沉淀為止；把上清液轉移到滅菌離心管中，加入2/3倍量上清液體積、并于-20℃預冷的異丙醇，輕輕晃動，于-20℃靜置過夜；4℃下離心5min，收集沉淀，棄去上清液，用75％(V/V)的乙醇漂洗沉淀2-3次，每次用量為連翹幼嫩葉片原材料重量體積的2倍，將離心管倒置在吸水紙上，風干，得風干物；每0.5g連翹幼嫩葉片原材料制得的風干物用50-60μLTE緩沖液溶解，并加入0.5μL5-10mg/mLRNase，輕輕混勻，于37℃水浴中溫浴30min，即得到高質量的可直接用于PCR擴增的連翹葉片基因組DNA；

所說的提取緩沖液I是由0.25mol/L?Tris-HCl、50mmol/L?EDTA、0.25mol/LNaCl和余量為水混合均勻制成；所說的提取緩沖液II是由100mmol/LTris-HCl，20mmol/L?EDTA，0.25mol/L?NaCl，0.025mol/L?Na₂B₄O₇和余量為水混合均勻制成。

2.根據權利要求1所述的提取連翹葉片DNA的方法，其特征在于：取0.5g連翹幼嫩葉片為材料，在研缽中加液氮迅速研磨成粉末，之后將粉末轉入滅菌離心管中，加入0-4℃預冷的提取緩沖液I?3-5mL，混勻，冰浴10min，4℃下6000-10000r/min離心10min，棄去上清液，再加入提取緩沖液II?3ml，混勻，冰浴10min，4℃下6000-10000r/min離心10min，棄去上清液，立即加入3-5mL65℃預熱的2×CTAB和60-120μL?β-巰基乙醇，充分混勻，在65℃水浴中保溫4h期間每隔0.5h輕輕搖動離心管一次；溫浴后，4℃下10000r/min離心10min；取上清液至5mL的滅菌離心管中，加入與上清液等體積的氯仿和異戊醇混合溶液，其混合溶液的配比是氯仿和異戊醇體積比24∶1，輕輕顛倒離心管，混勻，4℃下12000r/min離心10min，重復此操作，至上清液與氯仿和異戊醇混合溶液的液面無白色沉淀為止；把上清液轉移到滅菌離心管中，加入2/3倍量上清液體積、并于-20℃預冷的異丙醇，輕輕晃動，于-20℃靜置8-12小時過夜；4℃下8000r/min離心5min，棄去上清液，收集沉淀物，沉淀物用75％(V/V)的乙醇漂洗沉淀物2次或3次，每次1mL，將離心管倒置在吸水紙上，風干，得風干物；風干物用50-60μLTE緩沖液溶解，并加入0.5μL?5-10mg/mLRNase，輕輕混勻，于37℃水浴中溫浴30min，即得到高質量的可直接用于PCR擴增的連翹葉片基因組DNA。