[發(fā)明專利]可溶性截短的人TRAIL活性蛋白的制備方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010243089.6
• 申請(qǐng)日: 2010-07-30
• 公開（公告）號(hào): CN102021173A
• 公開（公告）日: 2011-04-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王行國(guó);葉青;陳凡
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 湖北大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/12
• 分類號(hào): C12N15/12;C12N15/70;C07K14/705;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/20;C07K1/18
• 代理公司: 武漢金堂專利事務(wù)所 42212
• 代理人: 丁齊旭

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及的是生物工程技術(shù)，特別是表達(dá)和制備可溶性截短的人TRAIL活性蛋白的方法。?

背景技術(shù)

腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(tumor?necrosis?factor-relatedapoptosis?inducing?ligand，TRAIL)，亦稱凋亡素2配體(Apo2ligand，Apo2L)。TRAIL是繼TNF和FasL之后被發(fā)現(xiàn)的第三個(gè)腫瘤壞死因子超家族的成員。人的TRAIL基因定位于染色體3q26，全長(zhǎng)1769bp，編碼281個(gè)氨基酸，蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為32.5kd，等電點(diǎn)為7.63，其中241個(gè)氨基酸位于胞膜外側(cè)，稱作可溶性TRAIL片段，功能部位為119-241位氨基酸。膜結(jié)合型TRAIL和可溶性TRAIL蛋白在體外均能誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，正常組織對(duì)TRAIL蛋白均不敏感。鑒于TRAIL蛋白在腫瘤治療中的潛在應(yīng)用價(jià)值，人們?cè)噲D將TRAIL蛋白可溶性片段開發(fā)成一種新的抗腫瘤藥物。為獲取較高純度的TRAIL蛋白，人們嘗試在各種真核或原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)TRAIL蛋白，并帶上不同的標(biāo)簽便于純化。在酵母等真核生物中表達(dá)，雖可獲得一定量的TRAIL蛋白，但成本較高且容易造成TRAIL蛋白的基團(tuán)修飾；在大腸桿菌等原核生物中表達(dá)，由于過量表達(dá)造成蛋白折迭不正常形成包涵體，可溶性蛋白產(chǎn)量很低。包涵體雖可通過變性復(fù)性工藝獲得復(fù)性的TRAIL蛋白，但僅適用于抗體制備而不適宜用作抗腫瘤藥物。另外，帶有標(biāo)簽的重組TRAIL蛋白雖有利于蛋白的純化，但最新的研究發(fā)現(xiàn)，修飾或加上標(biāo)鑒可改變TRAIL蛋白的生物學(xué)活性和功能，如帶His-標(biāo)簽的重組TRAIL蛋白不僅作用于腫瘤細(xì)胞而且作用于正常細(xì)胞。因此，無論對(duì)于開展TRAIL蛋白抗腫癌功能或機(jī)理的研究還是開發(fā)抗腫瘤藥物，制備未修飾、不帶任何標(biāo)簽的天然TRAIL蛋白或截短的TRAIL蛋白尤為重要?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提出了一種在大腸桿菌中高效表達(dá)可溶性TRAIL蛋白活性片段的方法和純化制備技術(shù)。根據(jù)細(xì)菌遺傳密碼的偏好性人工合成編碼截短的人TRAIL蛋白的DNA，插入通用的表達(dá)載體，并利用通用的大腸桿菌作宿主在17℃以下低溫表達(dá)的技術(shù)思路，在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)了截短的天然人TRAIL蛋白高效表達(dá)，克服了常規(guī)截短的天然人TRAIL蛋白高效表達(dá)時(shí)形成大量的不溶性包涵體問題。同時(shí)建立了三步法純化的蛋白制備技術(shù)，成功純化出高純度的天然可溶性人TRAIL蛋白。?

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的。具體操作步驟為：?

A、人工合成編碼截短的人TRAIL蛋白的DNA。人工合成24種DNA單鏈片段。根據(jù)Genebank發(fā)表的人TRAIL可溶性蛋白的氨基酸序列，按細(xì)菌遺傳密碼的偏好性設(shè)計(jì)24種寡聚DNA單鏈片段，并人工合成全部24種DNA單鏈片段。該片段為12種正鏈片段，12種負(fù)鏈片段，每種DNA片段約45個(gè)核苷酸長(zhǎng)，每一片段與相鄰片段之間具有8-10個(gè)核苷酸的重疊且能相互配對(duì)。?

B、三輪PCR合成完整的雙鏈DNA片段。將24種DNA單鏈片段分成2-3組，每組50μl的體系中加入濃度為10μM的每種寡聚DNA單鏈片段1.5μl、10×PCR反應(yīng)緩沖液5μl、2.5mM?dNTPs?4μl、Taq?DNA聚合酶0.4μl，并補(bǔ)加ddH₂O至50μl，進(jìn)行第一輪PCR。在PCR儀上94℃變性、52℃復(fù)性、72℃延伸，共擴(kuò)增20個(gè)循環(huán)。使用PCR清潔試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收。每組取2μl第一輪回收的PCR產(chǎn)物，加入10×PCR反應(yīng)緩沖液5μl、2.5mM?dNTPs?4μl、Taq?DNA聚合酶0.2μl，并補(bǔ)加ddH₂O至50μl并進(jìn)行第二輪PCR。在PCR儀上94℃變性、52℃復(fù)性、72℃延伸，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)。使用PCR清潔試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收。每組取2.5μl第二輪回收的PCR產(chǎn)物，加入10×PCR反應(yīng)緩沖液5μl、2.5mM?dNTPs4μl、帶限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的5’-和3’-端引物各1.5μl、Taq?DNA聚合酶0.4μl，并補(bǔ)加ddH₂O至50μl進(jìn)行第三輪PCR。在PCR儀上94℃變性、52℃復(fù)性、72℃延伸，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)。使用PCR清潔試劑盒回收PCR產(chǎn)物，得到全長(zhǎng)完整的雙鏈DNA片段。?