[發明專利]可溶性截短的人TRAIL活性蛋白的制備方法

無效

• 申請號: 201010243089.6
• 申請日: 2010-07-30
• 公開（公告）號: CN102021173A
• 公開（公告）日: 2011-04-20
• 發明（設計）人: 王行國;葉青;陳凡
• 申請（專利權）人: 湖北大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/70;C07K14/705;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/20;C07K1/18
• 代理公司: 武漢金堂專利事務所 42212
• 代理人: 丁齊旭

1.一種可溶性截短的人TRAIL活性蛋白的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

A、人工合成編碼截短的人TRAIL蛋白的DNA；根據Genebank發表的人TRAIL蛋白可溶性蛋白的氨基酸序列，按細菌遺傳密碼的偏好性設計24種寡聚DNA單鏈片段，人工合成全部DNA單鏈片段；

B、三輪PCR合成完整的雙鏈DNA片段；將24種DNA單鏈片段分成2-3組，每組50μl的體系中分別加入濃度為10μM的每種寡聚DNA單鏈片段1.5μl、10×PCR反應緩沖液5μl、2.5mM?dNTPs?4μl、Taq?DNA聚合酶0.4μl，并補加ddH₂O至50μl，進行第一輪PCR，共擴增20個循環，回收PCR產物；每組取2μl第一輪回收的PCR產物，加入10×PCR反應緩沖液5μl、2.5mM?dNTPs?4μl、Taq?DNA聚合酶0.2μl，并補加ddH₂O至50μl進行第二輪PCR，共擴增30個循環，回收PCR產物；每組取2.5μl第二輪回收的PCR產物，加入10×PCR反應緩沖液5μl、2.5mM?dNTPs?4μl、帶限制性內切酶位點的5’-和3’-端引物各1.5μl、Taq?DNA聚合酶0.4μl，并補加ddH₂O至50μl進行第三輪PCR，共擴增20個循環，回收PCR產物，得到全長完整的雙鏈DNA片段；

C、利用T-載擴增，將全長DNA片段克隆并轉化：將0.5μl回收的第三輪PCR產物與2μl?T-載連接緩沖液、0.2μl?pMD18-T載體DNA混合，加ddH₂O至5μl，混勻后16℃保溫4小時，取3μl連接反應液，按常規CaCl₂法轉化E.coliTop10，用含有50μg/ml氨芐青霉素的LB平板37℃培養12小時篩選陽性菌落，將單個陽性菌落送商業公司檢測插入的DNA序列正確性；

D、在大腸桿菌中高效低溫表達截短的人TRAIL蛋白

(1)將測序正確的陽性菌落接種至5ml含有50μg/ml氨芐青霉素的LB培養基中37℃培養12小時，并用質粒DNA抽提試劑盒抽提T-載重組質粒DNA，分別將20μl?T-載重組質粒和pET23a表達載體DNA與5μl?10×H緩沖液、2μlNdeI、2μlXhoI和21μl?ddH₂O混合，37℃酶切反應4小時，用1％瓊脂糖凝膠電泳分離限制性內切酶消化樣品，在紫外燈下用刀片切出目的DNA片段，然后按DNA片段回收試劑盒的方法回收目的DNA片段，然后在25μl的體系中，加入2.5μl?10×T₄DNA連接酶反應緩沖液，并按1∶5的比例加入限制性內切酶消化過的pET23a質粒DNA和編碼截短人TRAIL蛋白的DNA片段，再加入1μlT₄DNA連接酶，16℃水浴4-12小時形成重組表達質粒；

(2)利用常規的CaCl₂法制備E.coli?BL21(DE₃)感受態細胞，然后將5-10μl上述連接反應混合物與100μl感受態細胞混合，冰浴30分鐘，42℃熱休克1.5分鐘后立即置冰上5分鐘，加入900μl新鮮LB培養基后在37℃搖床上培養45分鐘，搖床轉速為150rpm，然后將細菌涂布在含100μg/ml氨芐青霉素的LB平板上，37℃培養12小時，平板上長出的單個菌落即為陽性轉化子；

(3)將單個的陽性轉化子接種到5ml含50μg/ml氨芐青霉素的LB培養基中37℃培養12小時，活化后菌液按1∶100接入在含有50μg/ml氨芐青霉素的LB培養基的搖瓶中17℃搖動培養，搖床轉速為250rpm，當OD₆₀₀值達到0.6時加入終濃度為0.5mM的IPTG誘導8-20小時，細胞經4500rpm離心15分鐘后收集并懸浮在含有1mM?DTT和5％甘油的50mM?TrisHCl緩沖液中(pH7.4)，超聲波破碎，12000rpm離心收集上清液；

E、截短人TRAIL蛋白的三步法純化

在50ml上清粗酶液中加入硫酸銨至終濃度40％，4℃放置2小時，12,000rpm離心15分鐘，去除沉淀，在離心后的上清液中加入硫酸銨至終濃度60％，4℃放置4-12小時，12,000rpm離心15分鐘，移去上清液，用20ml?50mM?TrisHCl(pH7.5)懸浮沉淀物，并用50mM?TrisHCl(pH7.5)4℃透析除去硫酸銨；

然后將樣品上樣至50mM?TrisHCl(pH7.5)平衡的CM-Sepharouse陽離子層析柱并用0-0.8M?NaCl進行梯度洗脫，流速為2ml/min，自動收集洗脫流出液，蛋白經10％SDS-PAGE電泳鑒定；

在含有截短人TRAIL蛋白的蛋白溶液中加入40％硫酸銨后，直接上樣Butyl-Sepharose層析柱(平衡用緩沖液為40％(NH₄)₂SO₄-50mM?TrisHCl(pH7.5))，用40％-0硫酸銨進行梯度洗脫，流速為2ml/min，自動收集洗脫流出液，10％SDS-PAGE電泳鑒定蛋白純度。?