[發明專利]人骨髓多能干細胞的體外擴增和向多巴胺能神經元定向分化的方法

無效

• 申請號: 201010241901.1
• 申請日: 2010-07-30
• 公開（公告）號: CN101935635A
• 公開（公告）日: 2011-01-05
• 發明（設計）人: 劉厚奇;范力星
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第二軍醫大學
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 上海德昭知識產權代理有限公司 31204
• 代理人: 丁振英

技術領域

本發明屬于生物醫學技術領域，具體涉及干細胞及細胞定向誘導分化領域，是一種人骨髓多能干細胞的體外擴增方法，以及人骨髓多能干細胞定向高效安全地分化為多巴胺能神經元樣細胞的方法。

背景技術

帕金森病Parkinson’s?Disease(PD)，由James?Parkinson醫生于1817年發現并命名，是一種慢性退行性神經疾病，老年人發病居多，目前在全世界人口中，超過1％的55歲以上老年人患有帕金森癥(Betarbet，R.，T.B.Sherer，and?J.T.Greenamyre，Animal?models?of?Parkinson′s?disease.Bioessays，2002.24(4)：p.308-18.Zhen-Xin?Zhang，Gwendolyn?E?P?Zahner，Parkinson’s?disease?in?China：prevalence?in?Beijing，Xian，and?Shanghai.Lancet?2005；365：595-97.)。帕金森癥的病理機制主要與大腦中腦黑質部位的多巴胺(Dopamine，簡稱DA)能神經元進行性損傷有關，DA神經元損傷引起多巴胺逆軸突轉運減少，從而導致中腦黑質與紋狀體間神經聯系減少，產生一系列的運動功能障礙，同時，PD患者黑質神經元內會出現lewy?bodies。臨床上以靜止性震顫、肌肉強直、運動遲緩為主要表現。帕金森癥中所缺乏的神經遞質：多巴胺DA，已經被研究得很深入，其主要作用就是神經系統的行為控制，以及控制大腦的情欲、感覺、興奮、開心等感覺，另外，多巴胺還與成癮性有關。目前對于帕金森癥的治療手段就是藥物替代療法，常用藥物為左旋多巴。但是必須指出，應用左旋多巴會導致一系列副作用，例如常見的胃腸道以及血管系統的不良反應，長期應用更會導致一些神經系統癥狀，如虛弱，不自主運動，開關現象等以及精神行為異常。鑒于帕金森病目前社會影響較大，并且目前療法急需改進，而最重要的是它是由單一種類細胞功能受損而引起的疾病，所以非常適合使用干細胞移植療法進行治療。

干細胞治療需要合適的種子細胞，并把種子細胞培養獲得適合移植使用的目標細胞，即多巴胺能神經元樣細胞。目前研究使用的胚胎干細胞(Embryonic?stem?cell，簡稱ESC)，是最早被分離得到的多能干細胞，體外培養可保持穩定增殖能力，具有向多個胚層方向分化的潛能，并且，ESC體外向DA神經元分化已有報道(Buytaert-Hoefen，K.A.，E.Alvarez，and?C.R.Freed，Generation?of?tyrosine?hydroxylase?positive?neurons?from?human?embryonic?stem?cells?after?coculture?with?cellular?substrates?and?exposure?to?GDNF.Stem?Cells，2004.22(5)：p.669-74.)。但是胚胎干細胞一般是來自于異源性組織的細胞，有免疫排斥的風險。雖然已經有成體細胞核移植獲得的ESC，即SCNT-ES，可避免免疫排斥反應，但依然存在在體內有形成畸胎瘤的風險，并且ESC的倫理學爭議較多。神經干細胞(Neural?stem?cells，簡稱NSC)，一般是來自于胚腦神經組織得到的，體外也可分化為大腦中幾乎所有類型的神經元，包括DA神經元(Lie，D.C.，et?al.，The?adult?substantia?nigra?contains?progenitor?cells?with?neurogenic?potential.J?Neurosci，2002.22(15)：p.6639-49.)。但是神經干細胞相比胚胎干細胞分化潛能低，單一譜系方向分化效率也較低，同時來源有限，且有倫理學爭議。近來，誘導性多能干細胞(Induced?pluripotent?stem?cells，簡稱IPS)的發現，使干細胞的應用范圍進一步擴大，IPS具有與胚胎干細胞相類似的全能性，且細胞可來自于自體，體外分化為DA神經元也有報道(Lewitzky，M.and?S.Yamanaka，Reprogramming?somatic?cells?towards?pluripotency?by?defined?factors.Curr?Opin?Biotechnol，2007.18(5)：p.467-73.)。但IPS在具有全能性的同時，體內也有形成畸胎瘤的風險，并且，IPS誘導過程中所導入的外源基因包括多能性基因以及載體序列對細胞影響的仍未明確。