[發明專利]人骨髓多能干細胞的體外擴增和向多巴胺能神經元定向分化的方法

無效

• 申請號: 201010241901.1
• 申請日: 2010-07-30
• 公開（公告）號: CN101935635A
• 公開（公告）日: 2011-01-05
• 發明（設計）人: 劉厚奇;范力星
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第二軍醫大學
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 上海德昭知識產權代理有限公司 31204
• 代理人: 丁振英

1.一種人骨髓多能干細胞的體外擴增方法，其特征在于采用人體骨髓，加入擴增培養基均勻分散后，剩余單個核細胞以100ng/ml纖連蛋白處理培養皿底，采用克隆化的純化方式，獲得可穩定增殖20代以上的骨髓多能干細胞，所述的擴增培養基成分由60％的DMEM、40％的MCDB、1％的ITS、4.7ug/ml?LA、luM的LAA、1mg/ml的HAS、1％的Pen/Strep、2％的FBS、lnM的Dex、10ng/ml的EGF和10ng/ml的PDGF組成。

2.根據權利要求1所述的人骨髓多能干細胞的體外擴增方法，其特征在于該方法具體步驟如下：

A、骨髓多能干細胞的原代培養

采用患者自體來源的骨髓，對其進行PBS沖洗2次，使用4℃預冷的0.16MTris-NH4Cl破紅處理5mins，1000轉/分離心5mins，去除裂解后紅細胞，PBS洗去多余的Tris-NH₄Cl，加入少量擴增培養基均勻分散后，剩余單個核細胞置于100ng/ml纖連蛋白預先處理過的細胞培養皿底部；CO₂培養箱(飽和濕度；95％air-5％CO2；37℃)中培養3天后全量換液，PBS洗去除懸浮未貼壁細胞，以后每3d半量換液1次，約10d左右達100％匯合后，0.25％Trypsin-EDTA消化成單細胞懸液，1∶2進行傳代，采用相同的培養基繼續培養；

擴增培養基成分如下

B、骨髓多能干細胞的克隆化培養和傳代

原代培養的骨髓細胞經過1周增殖后，進行克隆化培養獲得純化的骨髓?多能干細胞；使用有限稀釋法接種第二代骨髓細胞至96孔板，每孔接種數為1-5個/孔，依次擴大培養至24孔板，6孔板，6cm培養皿，10cm培養皿。

3、根據權利要求1或2所述的人骨髓多能干細胞的體外擴增方法，其特征在于獲得的人骨髓多能干細胞采用分期誘導法，第一期維甲酸加bFGF共同誘導7天，第二期SHH因子誘導14天，定向分化成多巴胺能神經元樣細胞。

4、根據權利要求1或2所述的人骨髓多能干細胞的體外擴增方法，其特征在于獲得的人骨髓多能干細胞，在匯合度＜30％低密度培養時，采用分期誘導法，第一期采用基礎培養基+100ng/ml的bFGF+10nM的RA誘導7天，第二期采用Neurabasal+250ng/ml的SHH因子誘導14天，所述的基礎培養基成分由60％的DMEM、40％的MCDB、1％的ITS、4.7ug/ml的LA、1uM的LAA、1mg/ml的HAS、1％的Pen/Strep和1nM的Dex組成，定向分化成多巴胺能神經元樣細胞。

5.一種人骨髓多能干細胞向多巴胺能神經元樣細胞定向分化的方法，其特征在于采用分期誘導法，第一期維甲酸加bFGF共同誘導7天，第二期SHH因子誘導14天。

6.根據權利要求5所述的人骨髓多能干細胞向多巴胺能神經元樣細胞定向分化的方法，其特征在于在匯合度＜30％低密度培養時，采用分期誘導法，第一期采用基礎培養基+100ng/ml的bFGF+10nM的RA誘導7天，第二期采用Neurabasal+250ng/ml的SHH因子誘導14天，所述的基礎培養基成分由60％的DMEM、40％的MCDB、1％的ITS、4.7ug/ml的LA、1uM的LAA、1mg/ml的HAS、1％的Pen/Strep和1nM的Dex組成。?