[發(fā)明專利]成體大鼠肝臟卵圓細胞系及其用途有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201010240107.5 | 申請日： | 2010-07-29 |
| 公開（公告）號： | CN102344903A | 公開（公告）日： | 2012-02-08 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 王萍;賈繼東;尤紅;馬紅;叢敏;劉天會;唐淑珍 | 申請（專利權(quán)）人： | 首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院 |
| 主分類號： | C12N5/071 | 分類號： | C12N5/071;A61L27/38;C12R1/91 |
| 代理公司： | 北京正理專利代理有限公司 11257 | 代理人： | 張文祎 |
| 地址： | 100050*** | 國省代碼： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 成體 大鼠 肝臟 細胞系 及其 用途 | ||
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種成體大鼠肝臟卵圓細胞系，屬于醫(yī)學生物技術(shù)領(lǐng)域。?
背景技術(shù)
盡管器官移植是目前臨床上治療終末期肝病較為安全、且行之有效的方法，然而供體肝臟短缺導致許多重癥肝衰竭患者在等待肝源的過程中死去，因而細胞移植有望成為替代器官移植治療終末期肝衰竭最值得期待的選擇。由于成熟肝細胞很難在體外大量擴增培養(yǎng)而且在培養(yǎng)過程中其肝臟特異性功能逐漸喪失，嚴重限制了應(yīng)用成熟肝細胞移植治療肝臟疾病的開展。由于肝臟干/前體細胞(hepatic?stem/progenitor?cells)不僅具有較強的增殖能力，而且具有分化為具有功能的成熟肝細胞的能力，因此，應(yīng)用肝干/前體細胞替代肝臟器官移植治療肝臟疾病成為最值得期待的一種選擇。?
肝臟卵圓細胞在1956年由Farber(Cancer?Res，1956，16(2)：142～148.)首次在乙硫氨酸和2-乙酰氨基芴(2-acetylaminofluorene，2-AAF)共同處理的大鼠肝組織中發(fā)現(xiàn)并命名，二十世紀八十年代由Thorgeirsson等(Cancer?Res，1987，47(20)：5469～5475.Cancer?Res，1989，49(6)：1541～1547.)證明為成體大鼠肝臟前體細胞，既往(Cancer?Res，1988，48(2)：368～378.Hepatology，1997，25(2)：329～334.)通常依據(jù)不同類型的細胞密度具有差別的原理，采用密度梯度介質(zhì)通過密度梯度離心的方法獲得該細胞，但不可避免的混有少量細胞密度與之相近的細胞而造成細胞純度不高的問題。?
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的第一個技術(shù)問題是提供一種特性穩(wěn)定、成分均一的成體大鼠肝臟卵圓細胞系rHOC，它能夠表達肝臟前體細胞的標志物；并能在體外條件下連續(xù)傳代培養(yǎng)100代且持續(xù)表達肝臟前體細胞的標志物，是良好的肝臟前體細胞研究模型。?
本發(fā)明要解決的第二個技術(shù)問題是提供一種成體大鼠肝臟卵圓細胞系的制備方法。?
本發(fā)明要解決的第三個技術(shù)問題是提供所述成體大鼠肝臟卵圓細胞系rHOC在體內(nèi)外定向誘導肝細胞中的應(yīng)用，以及在制備生物人工肝中的應(yīng)用。而且該細胞系還可以用于治療肝臟遺傳代謝性疾病、肝纖維化或肝硬化疾病的研究。?
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：?
本發(fā)明所述的成體大鼠肝臟卵圓細胞系rHOC經(jīng)鑒定確定為成體大鼠肝臟卵圓細胞，定名為rHOC，已于2010年7月23日保存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，并證明存活，其保藏登記編號為CGMCC?No.4057。保存地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼100101。?
所述成體大鼠肝臟卵圓細胞系rHOC具有以下生物學特性：?
(1)細胞呈典型的上皮細胞形態(tài)，連續(xù)傳代培養(yǎng)100代仍保持該形態(tài)特點；?
(2)細胞具有較強的增殖能力，但生長存在接觸抑制和密度抑制現(xiàn)象，連續(xù)傳代培養(yǎng)100代仍保持該增殖和生長特性；?
(3)細胞表達肝臟前體細胞標志物：肝臟卵圓細胞標志物(hepatic?oval?cellmarker，OV-6，Santa?Cruz)陽性率87.2％、Notch配基Delta樣蛋白(delta?drosophilahomolog-like?1，Dlk，Abcam)陽性率99.1％、甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP，R&D)陽性率98％、白蛋白(albumin，ALB，Bethyl)陽性率96％、細胞角蛋白19(cytokeratin?19，CK19，R&D)陽性率92％，連續(xù)傳代培養(yǎng)100代細胞仍保持上述免疫表型。?
為解決上述第二個技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種成體大鼠肝臟卵圓細胞系的制備方法，該方法包括以下步驟：?
(1)用含0.1％乙硫氨酸(Sigma-Aldrich)的膽堿缺乏性飼料喂養(yǎng)大鼠6周；?
(2)麻醉大鼠后無菌條件下行門靜脈插管，并進行原位灌流以去除血細胞；?
(3)切下肝組織，用含0.1％膠原酶(Sigma-Adlrich)溶液循環(huán)灌注以離散肝組織；?
(4)將步驟(3)灌流后的肝組織置于120目銅網(wǎng)上剪碎組織并研磨以獲得單細胞懸液；?
(5)收集步驟(4)的單細胞懸液并于4℃條件下1500rpm離心5分鐘以得到細胞沉淀；?
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