[發明專利]一種腸球菌屬多重PCR檢測引物及方法

無效

• 申請號: 201010240001.5
• 申請日: 2010-07-29
• 公開（公告）號: CN101880728A
• 公開（公告）日: 2010-11-10
• 發明（設計）人: 王亞賓;胡慧;孟振北;段志剛;陳麗穎;胡清林;耿鑫
• 申請（專利權）人: 河南農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/10;C12N15/11
• 代理公司: 鄭州中原專利事務所有限公司 41109
• 代理人: 張紹琳

技術領域

本發明涉及一種多重PCR檢測引物及方法，具體涉及一種腸球菌屬多重PCR檢測引物及方法。

背景技術

腸球菌為革蘭陽性球菌，主要存在于人類或動物的胃腸道，也廣泛分布于土壤，水，食物中，是一種重要的條件致病菌。近年來，由于腸球菌耐藥菌株的日益增多，腸球菌的醫院感染率不斷增加，引起尿路感染、菌血癥、創口感染、感染性心內膜炎以及食物中毒等，已成為醫院感染的重要病原。腸球菌可以感染多種動物，從豬、家蠶、羔羊、驢等動物體內均分離出致病性腸球菌，并且已有研究表明，腸球菌可以在人與動物之間進行水平傳播，有報道稱可由發病豬直接傳染人，引起人發病死亡。

目前，鑒定腸球菌的標準方法主要是依靠生化試驗進行表型鑒定，這需要大量的時間進行生化管的準備和判斷結果。另外，一些商品化鑒定試劑盒API?Rapid?ID?32Srep、BBL?Crystal和Vitek-32等，雖能夠將腸球菌鑒定到種的水平，檢測結果也能在24小時后得到有效判讀，且不適用基層快速鑒定，目前PCR儀普及率逐步提高，與單重PCR相比多重PCR具有高效性、系統性、經濟簡便性等優點，能在同一PCR反應管內同時檢出多個型別的目的基因，適宜于成組病原體檢測，節省時間，節省試劑，節約經費開支，能為臨床提供更多更準確的診斷信息，建立一種快速鑒定種屬的多重PCR方法顯得尤為必要。

發明內容

本發明要解決的技術問題是傳統的腸球菌屬和主要腸球菌種的檢測方法不適用基層快速鑒定，提供一種腸球菌多重PCR檢測引物及方法。

本發明的技術方案是：一種腸球菌屬多重PCR檢測引物，它的序列如下：

腸球菌屬引物的序列如下：

上游引物E1：5′-GTGTCGCTGATGGATGG-3′；

下游引物E2：5′-GCAAGCCGAACTGAGAGA-3′；

糞腸球菌種引物的序列如下：

上游引物FL1：5′-ACATATGTGAATAACTTAACC-3′；

下游引物FL2：5′-TATTGGTGACTCTTGGTTTGG-3′；

屎腸球菌種引物的序列如下：

上游引物FM1：5′-GATAATACAATAGAAGAATTAT-3′；

下游引物FM2：5′-AGCTTTTTTGATATTCTTCTTTA-3′。

利用腸球菌屬多重PCR檢測引物檢測腸球菌屬的方法，包括提取樣品的DNA后，用PCR反應體系和PCR反應程序對樣品進行檢測，

所述PCR反應體系，在25μl體系中加入以下成份：

2×PCRTaqMix??????????????8μl

E1/FL1/FM1????????????????3μl

E1/FL2/FM2????????????????3μl

模板DNA???????????????????2μl

dd?H₂O????????????????????9μl

????????????????????????????????????

總體積????????????????????25μl

所述PCR反應程序為：

95℃預變性5min；進入循環，94℃變性30s，49℃退火1min，72℃延伸1min?10s，30個循環；72℃終止10min。

本發明的有益效果是：本發明建立了一種快速準確鑒定腸球菌的多重PCR方法，大大簡化了查驗程序，可以在很多基層實驗室使用。能一次PCR鑒定到腸球菌屬及糞腸球菌或屎腸球菌種，能最少檢測出1ng的基因組DNA，敏感性高，特異性比較強，有利于腸球菌的鑒別與診斷，并且具有的較好敏感性、重復性和穩定性，為臨床中腸球菌的檢測提供了一種新的快速檢測方法，也為腸球菌感染的分子流行病學調查，研究腸球菌分子發病機制，早期診斷，診斷試劑盒的研制與開發，藥物或疫苗的免疫機制提供了試驗依據和技術手段。

本發明的檢測結果，將190株疑似菌株，其中，70株分離自患病豬組織病料；60株分離自健康豬糞便；60株分離自零售鮮豬肉分別進行多重PCR，結果顯示：糞腸球菌檢出率分別為30％、46.7％、25％，屎腸球菌檢出率分別為54.3％、38.3％、55％，其他腸球菌檢出率分別為7.1％、10％、13.3％。

附圖說明