[發(fā)明專(zhuān)利]一種基于熒光dUTP的自動(dòng)檢測(cè)SSR分子標(biāo)記的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010239919.8
• 申請(qǐng)日: 2010-07-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101899520A
• 公開(kāi)（公告）日: 2010-12-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 甘四明;李發(fā)根;翁啟杰;李梅;周長(zhǎng)品;于曉麗
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 廣州市越秀區(qū)哲力專(zhuān)利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 44288
• 代理人: 賀紅星

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種基于熒光dUTP在測(cè)序儀上自動(dòng)檢測(cè)SSR分子標(biāo)記的方法。

背景技術(shù)

SSR(Simple?sequence?repeats，簡(jiǎn)單序列重復(fù)，也稱(chēng)微衛(wèi)星)是一類(lèi)由幾個(gè)堿基串聯(lián)重復(fù)而成的DNA序列，其長(zhǎng)度一般較短(每單元長(zhǎng)度在1～6bp之間)，廣泛分布于基因組的不同位置。不同遺傳材料重復(fù)次數(shù)的可變性，導(dǎo)致了SSR標(biāo)記產(chǎn)生的基礎(chǔ)。SSR標(biāo)記是當(dāng)今流行的分子標(biāo)記技術(shù)之一，其原理為：根據(jù)SSR兩端的保守的單拷貝序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，通過(guò)PCR技術(shù)將其間的核心SSR序列擴(kuò)增出來(lái)，利用電泳分析技術(shù)就可以獲得其長(zhǎng)度多態(tài)性。為了滿(mǎn)足高通量和準(zhǔn)確性的需要，目前有條件的實(shí)驗(yàn)室都是通過(guò)測(cè)序儀進(jìn)行自動(dòng)化的電泳檢測(cè)。通過(guò)測(cè)序儀進(jìn)行SSR分子標(biāo)記自動(dòng)檢測(cè)的一大障礙是PCR產(chǎn)物必須具有熒光，以便激光探頭自動(dòng)識(shí)別熒光信號(hào)。

利用熒光dUTP進(jìn)行SSR分子標(biāo)記實(shí)驗(yàn)在教科書(shū)中尚未提及，至今只見(jiàn)報(bào)道有4篇文獻(xiàn)(文獻(xiàn)1：Patrick?K.E.M等，“Analysis?of?loss?of?heterozygosity?inmicrodissected?tumor?cells?from?Cervical?carcinoma?using?fluorescent?dUTP?labelingofPCR?products”，BioTechniques?21：844-847；文獻(xiàn)2：MacAvoy?E.S.等，“Geneticvariation?island?populations?of?tuatara?inferred?from?microsatellite?markers”，Conservatioin?Genetics?8：305-318；文獻(xiàn)3：Woolbright?S.A.等，“A?dense?linkagemap?of?hybrid?cottonwood?contributes?to?long-term?ecological?research?andcomparison?mapping?in?a?model?forest?tree”，Heredity?100：59-70；文獻(xiàn)4：BuschJ.D.等，“Development?of?polymorphic?tetranucleotide?microsatellites?for?Pinyonjays”，Conservation?Genetics?10：689-691)。但上述文獻(xiàn)中熒光信號(hào)偏弱，大大影響了譜帶判讀的準(zhǔn)確性。其中除文獻(xiàn)2中涉及的dNTP濃度為100μM(降落PCR，PCR反應(yīng)體系為25μL)之外，文獻(xiàn)1、3和4中報(bào)道的dNTP濃度均為200μM(一般PCR，PCR反應(yīng)體系為15～50μL)。由此可見(jiàn)，行業(yè)內(nèi)技術(shù)人員利用熒光dUTP進(jìn)行SSR分子標(biāo)記時(shí)幾乎均采用濃度為100～200μM的dNTP。

此外，分子生物學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員在進(jìn)行一般PCR反應(yīng)時(shí)使用的dNTP濃度為200μM，可參考C.W.迪芬巴赫等人著的《PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南》(科學(xué)出版社，1998，第1頁(yè))等。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述現(xiàn)有技術(shù)中的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種新的既能提高目的片段的熒光信號(hào)，從而提高標(biāo)記判讀的準(zhǔn)確性，又能合理節(jié)約反應(yīng)原料，降低成本、提高實(shí)驗(yàn)通量的方法。

本發(fā)明提供了一種基于熒光dUTP的自動(dòng)檢測(cè)SSR分子標(biāo)記的方法，包括以下步驟：

(1)配制PCR反應(yīng)體系：取1.0μL?10×buffer、dNTP?25～50μM、MgCl₂2.0mM、前向引物0.5μM、后向引物0.5μM、Taq酶1個(gè)單位、熒光dUTP?10pmol和基因組DNA?5ng混合，加超純水補(bǔ)至10μL；

(2)進(jìn)行降落PCR：94℃4min；20個(gè)循環(huán)：94℃30s、70～60℃或者66℃～56℃30s且每個(gè)循環(huán)降低0.5℃、72℃1min；再26個(gè)循環(huán)：94℃30s、60或者56℃30s、72℃1min；最后72℃10min，得PCR產(chǎn)物；

(3)取PCR產(chǎn)物1.0μL加入9.34μL超純甲酰胺、0.16μL分子量?jī)?nèi)標(biāo)，95℃5min后放置冰上快速冷卻，在測(cè)序儀上進(jìn)行標(biāo)記檢測(cè)。

步驟(1)中，dNTP為三磷酸脫氧核糖核苷(deoxy-ribonucleoside?triphosphate)的縮寫(xiě)。是dATP、dGTP、dTTP和dCTP的統(tǒng)稱(chēng)，在生物DNA合成以及PCR聚合酶鏈反應(yīng)中起原料作用。