[發明專利]在酵母中高效表達N-?；呓z氨酸內酯酶的DNA及其構建的工程菌

有效

• 申請號: 201010239510.6
• 申請日: 2010-07-27
• 公開（公告）號: CN101914556A
• 公開（公告）日: 2010-12-15
• 發明（設計）人: 周志剛;張宇婷;姚斌;曹雅男;張美超;何夙旭;劉玉春;孟昆
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院飼料研究所
• 主分類號: C12N15/57
• 分類號: C12N15/57;C12N9/50;C12N15/81;C12N15/63;C12N1/19;C12N5/10;C12R1/84
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;任鳳華

技術領域

本發明涉及在酵母中高效表達N-?；呓z氨酸內酯酶的DNA及其構建的工程菌。

背景技術

由于遺傳密碼具有簡并性，一種氨基酸可以有1-6個使用頻率不同的同義密碼子。對于特定的物種，高表達的基因往往使用部分特定的同義密碼子，這些密碼子被認為是該物種高表達基因的優越密碼子(optimal?codon)，這種現象稱為密碼子偏愛性(codon?bias)。密碼子的偏愛性使得克隆的外源基因往往難以在異種生物細胞高效表達。在酵母中獲得高效表達的外源基因往往都是酵母偏愛密碼子所編碼的基因，通過對酵母基因使用密碼子的統計分析證實所有的61個密碼子中有25個是酵母所偏愛的，因此對密碼子進行偏愛性改造能大量提高重組蛋白在該系統中的表達量。

N-?；呓z氨酸內酯酶是一類特異性降解N-?；呓z氨酸內酯類信號分子(AHLs)的蛋白水解酶，通過水解AHLs生成?；呓z氨酸，使AHLs失去活性，從而阻斷病原菌的群體感應機制，使病原菌失去致病能力，其廣泛存在于多種微生物中。近年來N-?；呓z氨酸內酯酶作為一種新型抗菌策略(群體感應淬滅策略)的工具酶而成為研究的熱點。

目前主要是通過構建轉基因植物、轉基因細菌研究其在群體感應淬滅中的作用機制，而轉基因植物或轉基因細菌在實際應用中存在生物安全和有效性方面的問題。

發明內容

本發明的目的是提供在酵母中高效表達N-?；呓z氨酸內酯酶的DNA及其構建的工程菌。

本發明提供的DNA分子，為如下(a)或(b)：

(a)序列表的序列2自5’末端第7至759位核苷酸所示的DNA；

(b)序列表的序列2所示的DNA。

含有所述DNA分子的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌均屬于本發明的保護范圍。

所述重組表達載體可為在pPIC9載體的多克隆位點插入所述DNA分子得到的重組質粒，優選為在pPIC9載體的EcoR?I和Not?I酶切識別位點之間插入所述DNA分子得到的重組質粒。

所述重組菌可為在宿主菌中導入所述DNA分子得到的重組菌，具體可為在宿主菌中導入所述重組表達載體得到的重組菌。所述宿主菌可為畢赤酵母(Pichia?pastoris)，具體可為畢赤酵母(Pichia?pastoris)GS115，優選巴斯德畢赤酵母(Pichia?pastoris)AiiA-B546M，CGMCC?No.3975。

巴斯德畢赤酵母(Pichia?pastoris)AiiA-B546M，CGMCC?No.3975已于2010年7月02日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為：北京市朝陽區北辰西路1號院3號)，保藏號為CGMCC?No.3975。

所述的重組菌可用于生產N-?；呓z氨酸內酯酶。

本發明還保護一種生產N-?；呓z氨酸內酯酶的方法，是培養所述重組菌，得到N-酰基高絲氨酸內酯酶。

所述方法具體可為：30℃、250-280rpm(4-5×g)培養所述重組菌，得到N-酰基高絲氨酸內酯酶；培養過程中采用甲醇誘導。所述甲醇在所述培養液中的濃度優選為0.5％(體積百分含量)。所述N-?；呓z氨酸內酯酶的底物具體可為N-3-氧-辛酰高絲氨酸內酯(3-oxo-C8-HSL)。

本發明在現有N-?；呓z氨酸內酯酶基因aiiaB546的基礎上，對其DNA序列進行優化，改造成酵母偏愛密碼子所編碼的基因，得到了優化后的基因aiiaB546M，該優化后基因在畢赤酵母中的表達能力顯著高于優化前基因。本發明構建了含有aiiaB546M的重組表達質粒，將該重組表達質粒導入畢赤酵母，可以得到高效高絲氨酸內酯酶的重組菌。其中一株重組菌的表達能力尤為高效。本發明可以降低N-?；呓z氨酸內酯酶生產成本，提高應用的安全性和有效性，對于高絲氨酸內酯酶的生產具有重大價值。

附圖說明

圖1為優化前基因和優化后基因的比對。

圖2為aiiaB546M/pUC57的電泳圖；1為1kb?plus?ladder?Marker；2為質粒aiiaB546M/pUC57。

圖3為酶切后質粒的電泳圖；1為為pPIC9載體雙酶切片段；2為質粒aiiaB546M/pUC57雙酶切后的兩條片段，目的基因aiiaB546M為753bp；3為1kb?plusladder?Marker。

具體實施方式