[發(fā)明專利]一種抗諾龍的特異性抗體

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010237956.5
• 申請日: 2010-07-27
• 公開（公告）號: CN102336830A
• 公開（公告）日: 2012-02-01
• 發(fā)明（設計）人: 王碩;張燕;王俊平;王莉
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C07K14/765
• 分類號: C07K14/765;C07K14/795;C07K16/44;C07K16/06;C07J1/00;G01N33/535
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技術領域

本發(fā)明涉及選擇一種最大可能包含諾龍原有結構的化合物作為諾龍半抗原，并將半抗原制成抗原、進而產(chǎn)生抗體；以及此類半抗原、抗原的合成與抗體制備方法。本發(fā)明屬于生物技術領域。

背景技術

隨著全球經(jīng)濟一體化和食品貿(mào)易國際化，食品安全已成為一個世界性的挑戰(zhàn)和全球重要的公共衛(wèi)生問題。隨著人們生活水平的提高，人們越來越關注自己的健康，功能食品也日益受到人們的青睞。但是隨之而來的功能食品中摻假現(xiàn)象日益嚴重，嚴重危害著消費者的身心健康。近年來，功能食品的安全問題日益突出，對于食品中摻假物質(zhì)檢測技術也提出了新的要求，研究者正在積極尋求能滿足以下幾個方面特點的食品快速檢測與分析方法：高靈敏度；高特異性；寬適用范圍，可測定各類功能食品；低檢測費用；易商品化。免疫檢測是目前符合這一要求的使用最為廣泛的快速檢測技術。

諾龍具有較強的毒副作用，可引起癌癥，肝炎和神經(jīng)混亂。功能食品中惡意摻加諾龍極易對人體造成危害，因此對功能食品中諾龍的檢測具有重要意義。由于17β-NT在功能食品中的的添加都很微量，同時功能食品的成分一般比較復雜，基質(zhì)影響很難消除，常規(guī)檢測方法很難達到理想的檢測效果，因此迫切需要建立一種經(jīng)濟、可靠、特異、敏感、快速有效的方法。

針對功能食品的惡意摻假現(xiàn)象，本論文制備出摻假物諾龍的高靈敏度、特異性強的抗體，建立簡單、快速的諾龍固相萃取-酶聯(lián)免疫檢測方法，為功能食品鑒偽提供一種可靠的技術支撐。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明設計合成了小分子目標分析物半抗原，并與載體蛋白質(zhì)偶聯(lián)，制備有效人工抗原，免疫動物制備對小分子分析物特異性抗體，利用抗原抗體的特異性免疫學反應和易被檢測識別的標記物的放大作用，從而定性定量的檢測樣本中超微量小分子目標物，可用于樣本測定。該技術研究的關鍵是半抗原的分子設計、合成和全抗原及抗體的制備。

本發(fā)明為達到以上目的所設計的技術方案是合成分子結構式如下圖所示的諾龍半抗原

，然后將半抗原與載體蛋白聯(lián)接合成人工抗原，免疫動物，獲得抗體。

(1)精確稱取0.5488mg諾龍溶于13.5mL無水四氫呋喃中，加入0.4g丁二酸酐，0.55mL三乙胺和0.243mg?DMAP，60℃反應過夜，將溶劑懸蒸至干。

(2)將所得殘渣用有機溶劑乙酸乙酯/石油醚(1/1，v/v)溶解后，過層析柱純化。經(jīng)過優(yōu)化，最終選擇乙酸乙酯/石油醚(1/1，v/v)為展開劑。將得到的濾液旋蒸后得到白色晶體，即為17β-NT半抗原。

(3)人工抗原的合成：分別精確稱取上述所得17β-NT半抗原0.025mmol(9.36mg)和9.3mg?EDC，溶于1mL?N-N二甲基甲酰胺(DMF)溶液中。將此溶液在冰浴中逐滴加入2mL濃度為5mg/mL的蛋白BSA溶液中(10mg?BSA溶于2mL?130mmol/L碳酸氫鈉緩沖液中，pH?8.1)，攪拌，室溫下反應5h；再精確稱取4.7mg?EDC加入反應液中，攪拌，4℃反應過夜，然后將反應液在4℃、pH?7.4的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中透析三天，然后精確量取蛋白質(zhì)偶聯(lián)物溶液的體積，測定濃度加入疊氮鈉，分裝，-20℃保存。

(4)、包被原的制備

用諾龍半抗原與OVA連接即制成包被抗原，用于包被反應。

(5)、抗體的制備及純化：

免疫動物選擇日本大耳白兔2只，月齡3個月，體重1.5公斤左右，分別編號為1號、2號。免疫采取皮下和肌肉注射法共同進行。

免疫程序：初次免疫：為提高抗原的免疫性，采用由弗氏完全佐劑乳化的免疫原，劑量為1mg，溶于1mL?0.9％的NaCl，再與1mL的弗氏完全佐劑混合進行乳化。加強免疫：初次免疫后第14天和28天進行加強免疫，劑量為0.5mg，溶于1mL?0.9％的NaCl，再與1mL的弗氏不完全佐劑混合進行乳化。以后每隔28天加強免疫一次，共免疫6次。從第2次加強免疫開始，每次免疫10天后對動物試采血進行血清效價測定和親和力測定。末次免疫后采用股動脈采血法對動物采全血，經(jīng)離心處理后收集全部血清，采取免疫親合層析法進行抗體純化，所得抗體添加0.1％(W/V)的疊氮鈉后于4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

血清效價檢測方法的步驟：